Stimuli-responsive DNA-based enzyme cascade
No Thumbnail Available
URL
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Kemian tekniikan korkeakoulu |
Master's thesis
Ask about the availability of the thesis by sending email to the Aalto University Learning Centre oppimiskeskus@aalto.fi
Authors
Date
2018-01-22
Department
Major/Subject
Biosystems and Biomaterials Engineering
Mcode
CHEM3028
Degree programme
Master’s Programme in Life Science Technologies
Language
en
Pages
59+8
Series
Abstract
DNA Nanotechnology utilizes DNA as a building material for the construction of various two- (2D) and three-dimensional (3D) nanoscale objects. The ability to functionalize these objects at the nanometer-level has inspired researchers to assemble, for example, enzyme cascades on the surface of DNA nanostructures to mimic the multienzyme complexes found in Nature. In this thesis, a stimuli-responsive DNA nanostructure was constructed using the DNA origami technique. A two-enzyme cascade, glucose oxidase-horseradish peroxidase, was assembled on the DNA origami, which enabled to control the distance between the enzymes and thus determine, whether close proximity enhances the activity of the cascade. Efficient binding of enzymes onto DNA origami was achieved by heterobifunctional crosslinking and purification of both enzymes was successfully achieved by polyethylene glycol (PEG) precipitation method. Activity measurements of the cascade were performed by spectroscopic methods. The results indicate that proximity alone is not sufficient to increase the cascade activity and induce channeling of the intermediates between the two enzymes. Other factors, such as control over the geometry of the active sites should be considered along with proximity to evoke channeling of the intermediates and thereby increase the cascade efficiency.DNA-nanoteknologia hyödyntää DNA:ta rakennusmateriaalina erilaisten nanomittakaavan 2D- ja 3D-objektien rakentamiseen. Kyky muokata näitä objekteja nanomittakaavan tarkkuudella on innoittanut tutkijoita kokoamaan esimerkiksi entsyymikaskadeja DNA-objektien pinnalle. Näiden rakennelmien tarkoituksena on jäljitellä luonnossa esiintyviä entsyymikomplekseja. Tässä diplomityössä hyödynnettiin DNA-origami -tekniikkaa luomaan ulkoisiin ärsykkeisiin reagoiva DNA-pohjainen nanorakenne. Tämän pinnalle kiinnitettiin entsyymikaskadi, joka koostuu glukoosioksidaasista ja piparjuuriperoksidaasista. Ärsykkeisiin reagoivan DNA-nanorakenteen avulla pystyttiin kontrolloimaan entsyymien välimatkaa ja täten määrittelemään, vaikuttaako entsyymien etäisyys toisistaan kaskadin aktiivisuuteen. Entsyymien kiinnittäminen DNA-origamiin suoritettiin silloittavan reagenssin avulla ja entsyymien puhdistuksessa hyödynnettiin niin sanottua PEG-saostamiseen perustuvaa menetelmää. Aktiivisuusmittaukset suoritettiin spektroskooppisilla menetelmillä. Tulokset osoittavat, että entsyymien läheisyys yksin ei ole riittävä lisäämään entsyymikaskadin aktiivisuutta ja siten aiheuttamaan substraattien kanavointia entsyymien välillä. Jotta entsyymikaskadin tehokkuutta voitaisiin parantaa, muita mekanismeja, kuten aktiivisten keskusten suuntaus, tulisi entsyymien etäisyyden lisäksi ottaa huomioon.Description
Supervisor
Kuzyk, AntonThesis advisor
Linko, VeikkoKeywords
DNA origami, DNA nanotechnology, enzyme cascades, GOx, HRP, stimuli-responsive materials