An AMA plasmid-based CRISPR-Cas9 genome editing tool for a non-model filamentous fungus
No Thumbnail Available
URL
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Kemian tekniikan korkeakoulu |
Master's thesis
Authors
Date
2024-05-20
Department
Major/Subject
Biosystems and Biomaterials Engineering
Mcode
CHEM3028
Degree programme
Master’s Programme in Life Science Technologies
Language
en
Pages
52 + 11
Series
Abstract
This thesis aimed to develop a CRISPR-Cas9 genome editing tool for the non-model fila-mentous fungus Paecilomyces variotii employing the AMA plasmid since a lack of selection markers and low frequency of gene targeting is a common problem in filamentous fungi genome editing. AMA1 is the origin of replication and has been effectively employed in many filamentous fungi, including Aspergillus species. Since the AMA plasmid is rarely integrated into the genome and is easily removed after transformation, it may provide a solution especially related to these challenges. The efficiency of the constructed AMA plasmid-based approach was tested for gene deletion, gene insertion, and editing of several genes simultaneously. Two different strategies were chosen to implement AMA-based gRNA expression which were ribozymes flanked sgRNA transcript synthesized by Pol II promoter and sgRNA transcript driven by Pol III U6 promoter. As a result, the U6 promoter-based AMA plasmid approach was proven to be capable of gene deletions and achieved a 53% efficiency rate in gene insertion. The Ribozyme-based approach yielded weaker efficiency, although it was proved to be functional for both gene deletion and insertion. The simultaneous editing of multiple genes could not be achieved and requires further development and optimization.Opinnäytetyön tavoitteena oli kehittää CRISPR-Cas9 genomin muokkaustyökalu vähän tutkitulle rihmasienelle, Paecilomyces variotii:lle. Tämä tavoite toteutettiin AMA-plasmidin avulla, sillä selektiomarkkereiden puute ja alhainen geenikohdistustarkkuus ovat yleinen ongelma rihmasienten genomin editoinnissa. AMA1- sekvenssi on replikaation aloituskohta, ja sitä on käytetty tehokkaasti monissa rihmasienissä, mukaan lukien Aspergillus-lajeissa. Koska AMA-plasmidi harvoin integroituu genomiin ja se on helposti poistettavissa transformaation jälkeen, se voi tarjota ratkaisun erityisesti selektiomarkkereiden puutteeseen liittyviin haasteisiin genomin muokkauksen yhteydessä. Rakennetun AMA-plasmidipohjaisen lähestymistavan tehokkuutta testattiin geenipoiston, geenin lisäämisen ja useiden geenien samanaikaisen muokkaamisen näkökulmasta. Kaksi erilaista lähestymistapaa valittiin toteuttamaan AMA plasmidipohjaista sgRNA ilmentymistä. Nämä olivat ribotsyymien ympäröimä sgRNA-transkriptio, joka oli ilmennetty Pol II -promoottorilla sekä sgRNA:n transkriptio, joka oli ilmennetty Pol III U6 -promoottorilla. Tulokset osoittivat, että U6-promoottori lähestymistapa oli kykenevä tuottamaan geeni deleetioita ja sillä saavutettiin 53 % tehokkuus aste geenin liittämisessä haluttuun kohteeseen. Ribot-syymipohjainen lähestymistapa tuotti heikkoja tuloksia, mutta onnistui todistetusti sekä geenin poistossa että liittämisessä. Useiden geenien samanaikaista muokkaamista ei onnistuttu saavuttamaan.Description
Supervisor
Linder, MarkusThesis advisor
Rantasalo, AnssiKeywords
Paecilomyces variotii, fungal gene editing, CRISPR-Cas9, AMA plasmid