Development of a transformation protocol and effects of auto- and heterotrophic conditions to the transcription of genes and microbial growth in hydrogen-oxidizing bacterium belonging to genus Nocardioides sp.
No Thumbnail Available
URL
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Kemian tekniikan korkeakoulu |
Master's thesis
Authors
Date
2020-12-15
Department
Major/Subject
Biotechnology
Mcode
CHEM3022
Degree programme
Master's Programme in Chemical, Biochemical and Materials Engineering
Language
en
Pages
54 + 5
Series
Abstract
Many research areas try to answer the problem of increasing atmospheric CO2 and its industrial emissions. The use of microbes that are able to fix CO2, has a potential to answer this question biotechnologically. In addition to cyanobacteria and algae, hydrogen-oxidizing bacteria, so called Knallgas bacteria, are capable to utilize CO2, and convert it to metabolic organic compounds and biomass. Knallgas bacteria are also able to derive energy by oxidizing molecular hydrogen by hydrogenase enzymes. In applications related to Knallgas bacteria, CO2 fixation is used to produce food and feed in a form of a microbial protein, chemicals and bio-based polymers. The aim of the thesis was to establish a transformation protocol for a Knallgas bacterium belonging to Nocardioides sp., characterize its heterotrophic carbon source preferences and determine its growth curves under auto- and heterotrophic conditions. Genome wide transcription profiling was performed for cells grown on glucose and CO2. The bacterium was cultivated on different organic carbon compounds to determine the preferred carbon source for its growth. The bacterium showed growth on glucose and on xylose. Of other tested compounds, only glycerol was accepted as a carbon source. Determination of growth curves of the bacterium cultivated on CO2 and glucose. When the cultivations were started at different initial OD600 values, initial OD600 0.5 resulted highest growth on glucose where OD600 reached up to 30 and glucose was totally consumed. Genome wide transcription profiling was performed by isolating RNA samples from cells grown on CO2 and on glucose. RNA isolation was carried out successfully and RNA sequencing was outsourced to get bioinformatics data. Data showed that e.g. gene encoding ribulose-1,5-bisphophate carboxylase in Calvin cycle was induced even 600 times more under autotrophic conditions compared to heterotrophic conditions. Gene encoding periplasmic hydrogenase involved in hydrogen oxidation was also transcribed 12 times higher on CO2. The development of a transformation protocol for the bacterium was carried out using different electroporation and conjugation protocols based on literature. Plasmid constructs with different promoter, operon and replicative areas were cloned for transformation experiments. Experiments showed that electroporation of a linearized plasmid DNA with an endogenous promoter area in front of the selection marker gene resulted in positive transformants. However, the plasmid DNA was not integrated into the targeted locus of genomic DNA by homologous recombination and was lost from the cells, indicating that further improvement is needed. Elucidation of the functions and creating molecular genetic modification tools for the novel Knallgas bacterium is useful when developing commercial applications in the future. The general goal of reducing CO2 emissions with biotechnology applications is closer, if efficient CO2 fixation methods are developed.Monilla tieteenaloilla yritetään keksiä ratkaisua ongelmaan, jossa hiilidioksidin määrät sekä teollisuuden päästöt kasvavat. Hiilidioksidia hyödyntävien mikrobien käyttö bioteknologisissa sovellutuksissa voi olla osana ratkaisemassa tätä ongelmaa. Syanobakteerien ja levien lisäksi vetyö hapettavat bakteerit, niin kutsutut Knallgas bakteerit hyödyntävät hiilidioksidia (CO2) ja muuntavat sen metaboliiteiksi sekä biomassaksi. Knallgas bakteerit tuottavat solutoimintoihin energiaa hapettamalla vetyä hydrogenaasi entsyymien avulla. Sovellutuksissa Knallgas bakteereja voidaan hyödyntää mikrobiproteiinin, kemikaalien ja bio-polymeerien tuottamisessa. Tutkielman tarkoitus oli kehittää transformaatio protokolla uudenlaiselle Knallgas bakteerille, joka kuuluu Nocardioides sp. -sukuun, määrittää sen heterotrofiset hiilenlähteet sekä kasvukäyrät auto- ja heterotrofisissa olosuhteissa. Transkriptioprofilointi tehtiin genomin laajuisesti vertaillaksemme soluja, jotka olivat kasvaneet glukoosilla ja hiilidioksidilla. Heterotrofisten hiilen lähteiden selvittämiseksi bakteeria kasvatettiin eri hiilenlähteillä. Bakteeri kasvoi sekä glukoosilla, että ksyloosilla. Pientä kasvua tapahtui myös glyserolilla. Solukasvatukset glukoosilla ja hiilidioksidilla tehtiin, jotta kasvukäyrä kummallakin hiilenlähteellä saatiin selvitettyä. Kun siirrostettujen kasvatusten aloitus OD600 arvoja verrattiin keskenään, suurin kasvu saatiin siirrostuksesta, jossa aloitus OD600 oli 0.5. Tällöin bakteerit kasvoivat OD600 30 asti ja solute käyttivät kasvuliuoksessa olevan glukoosin kokonaan loppuun. Transkriptioprofilointi tehtiin eristämällä RNA näytteet solukasvatuksista, jotka olivat kasvaneet glukoosilla ja hiilidioksidilla. RNA eristys onnistui hyvin, jonka jälkeen näytteet lähetettiin sekvensoitavaksi ulkopuoliselle palveluntarjoajalle. Saadun datan perusteella geenit, jotka koodaavat esimerkiksi ribuloosi-1,5-bifosfaatti karboksylaasia entsyymiä Calvinin syklissä indusoituivat jopa 600 kertaa sekä vedyn hapettumista katalysoiva preiplasminen hydrogenaasi indusoitui jopa 12 kertaa enemmän soluissa, jotka kasvoivat hiilidioksidilla. Kirjallisuudesta etsittiin erilaisia elektroporaatio ja konjugaatio protokollia, joita käytettiin tehokkaan transformaatio protokollan kehittämiselle. Transformaatiota varten erilaisia plasmideita eri promoottoreilla, operonialueilla ja replikoivilla alueilla kloonattiin. Tutkimukset osoittivat, että elektroporaatio toimi tehokkaana menetelmänä tuottaen positiivia transformantteja, kun plasmidi sisälsi endogeenisen promoottorialueen ja plasmidi transformoitiin soluun lineaarisessa muodossa. Transformoitu plasmidi DNA ei kuitenkaan integroitunut osaksi bakteerin genomia homologisen rekombinaation avulla eikä säilynyt pysyvästi soluilla. Tämän vuoksi transformaatioprotokollaan tarvitaan vielä lisää parannuksia. Toimintojen karakterisointi ja geneettisten työkalujen kehittäminen on hyödyllistä, kun Knallgas bakteerien kaupallisia sovellutuksia halutaan kehittää. Kun näissä onnistutaan, ollaan askeleen lähempänä yleistä tavoitetta CO2 päästöjen vähentämisessä.Description
Supervisor
Scheller, SilvanThesis advisor
Salusjärvi, LauraNyyssölä, Antti
Keywords
Knallgas bacteria, carbondioxide, transcription profiling, transformation