Ribosomal protein S1 mutants for improved translation initiation in Escherichia coli
No Thumbnail Available
URL
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Kemian tekniikan korkeakoulu |
Master's thesis
Authors
Date
2018-11-05
Department
Major/Subject
Biosystems and Biomaterials Engineering
Mcode
CHEM3036
Degree programme
Master’s Programme in Life Science Technologies
Language
en
Pages
82 + 0
Series
Abstract
Metagenomes, i.e. DNA extracted from a certain environment at a certain time point, present a source for novel enzymes, but only under 1 % of micro-organisms are cultivatable. Functional metagenomic screening approaches are sequence independent methods for finding novel enzymes or functions in the coding sequences of the metagenomes. In these activity based methods metagenomic libraries are created and these are screened in host-organisms, often E. coli, as it has a wide genetic engineering toolbox. Still, the expression of metagenomic sequences in E. coli is a challenge because of differing expression machineries. It has been observed that metagenomic sequences in E. coli seem to have a high GC-content. GC-rich sequences form secondary structures which may interfere with translation initiation. Ribosomal protein S1 is an essential factor for initiating translation in E. coli. This protein consists of six domains. Its domains three to five have a significant role in binding and unfolding mRNA. The aim of this thesis was to modify S1 ribosomal protein to achieve a more relaxed translation initiation of metagenomic sequences in E. coli. This was done by creating two mutation libraries of ribosomal protein S1. The first mutation library covered domains three to four and the second mutation library covered domains three to five. Reporter systems were employed for selecting mutants and screening them with each other and the wild type. The reporter systems were constructed of a metagenomic 5’untranslated regions (UTR) linked to a fluorescence protein encoding region. Six different 5’UTRs were employed for six different GFP reporters. An operon reporter was constructed of three different metagenomic 5’UTRs and three different fluorescence protein encoding regions (GFP, mOrange, mApple). The mutant S1 ribosomal proteins were screened with the reporter plasmids in E. coli. Fluorescence values were used for hit selection and comparing the protein expression results between mutants and the wild type. The operon reporter was employed to achieve a more relaxed selection. Six selected S1 mutants from mutation library D3-D4 showed expression values of the GFP reporters ranging from 77 % to 195 % compared to the wild type S1. The nine S1 mutants from mutation library D3-D5 presented expression values of all the GFP reporters between 71 % and 191 % compared to the wild type S1. Two of the nine S1 mutants increased expression of all the six GFP reporters. Seven S1 mutants increased expression of some of the GFP reporters. Further analysis of the three most promising mutants suggested that many of the mutations led to activity changes of S1 protein and mRNA interactions. Relaxed fidelity of S1 mutants seems to be a working concept for increasing expression of metagenomic sequences, and the S1 mutants created in this study show potential for future functional screens with E. coli. Nevertheless, further experiments for confirmation of functionality should be conducted.Metagenomi on tietystä ympäristöstä, tiettynä aikana eristettävä DNA. Metagenomit ovat lähde uusille entsyymeille, mutta ainoastaan alle 1 % mikro-organismeista on kasvatettavissa laboratorio-olosuhteissa. Toiminnalliset seulontamenetelmät ovat sekvenssistä riippumattomia menetelmiä, joiden tarkoituksena on löytää uusia entsyymejä koodaavia geenejä. Nämä menetelmät perustuvat metagenomisten kirjastojen luomiseen ja seulomiseen isäntäeliössä. Isäntäeliönä käytetään usein E. colia, sen tunnettuuden ja helpon muokattavuuden vuoksi. Metagenomisten sekvenssien ilmentäminen E. colissa on silti haastavaa erilaisten geenien ilmentämiseen tarvittavien koneistojen takia. Metagenomisilla sekvensseillä on huomattu olevan E. colissa korkea GC-pitoisuus. Sekvenssit, joissa on korkea GC-pitoisuus, muodostavat herkästi sekundaarirakenteita, jotka voivat häiritä translaation alkamista. Ribosomaalinen S1 proteiini on erittäin merkittävä tekijä translaation aloittamiselle E. colissa. S1 proteiini koostuu kuudesta proteiinialayksiköstä. Alayksiköt kolmesta viiteen ovat merkittävässä osassa lähetti-RNA:n sitomisessa ja sekundaarirakenteiden purkamisessa. Työn tarkoitus oli muokata ribosomaalisesta S1 proteiinista epäspesifisempi, jotta translaatio olisi mahdollista aloittaa suuremmasta kirjosta sekvenssejä ilman vinoumaa. Työtä varten luotiin kaksi mutaatiokirjastoa. Ensimmäinen kirjasto käsitti proteiinialayksiköt kolmesta neljään ja toinen kirjasto proteiinialayksiköt kolmesta viiteen. Työssä käytettiin kahta reportterisysteemiä mutanttien valintaan ja seulontaan. Reportterit koostuivat metagenomisesta 5’UTR:sta (ei-transloitu alue), ja tämän kontrolloimasta fluoresenssiproteiinia koodaavasta alueesta. Kuusi eri metagenomista 5’UTR:a kontrolloi kuutta eri GFP reportteria. Operoni reportteri koostui kolmesta metagenomisesta 5’UTR:sta ja näiden hallitsemista fluoresenssiproteiineja koodaavista sekvensseistä. Operoni reportteria käytettiin epäspesifisemmän valinnan aikaansaamiseksi. Seulontasysteemeissä S1 mutantit ja reportterit siirrettiin E. coliin ja fluoresenssiarvoja käytettiin mutanttien valintaan sekä mutanttien ja villikannan toiminnan vertailuun. Kuusi mutaatiokirjaston 3-4 mutanttia osoitti villikantaan verrattuna 77 % - 195 % GFP:n ilmentymisarvoja. Yhdeksän mutanttia oli valittu mutaatiokirjastosta 3-5. Nämä mutantit osoittivat 71 % - 191 % GFP:n ilmentymisarvoja villikantaan verrattuna. Kaksi yhdeksästä mutantista osoitti kohonneita ilmentymisarvoja kaikkien GFP reporttereiden kohdalla. Seitsemän mutanttia osoitti kohonneita ilmentymisarvoja osan GFP-reporttereita kohdalla. Kolme kaikkein lupaavinta mutanttia valittiin jatko-analyyseihin. Vaikutti siltä, että monet mutaatioista johtivat S1 proteiinin ja lähetti-RNA:n vuorovaikutuksen toiminnon muutoksiin. S1 mutanttien epäspesifisyys vaikuttaa toimivalta konseptilta lisätä metagenomisten sekvenssien ilmentymistä. Tässä diplomityössä kehitetyillä mutanteilla on mahdollisuus vaikuttaa tulevaisuuden toiminnallisiin seulontamenetelmiin joissa E. colia käytetään isäntäeliönä. Tämä voisi mahdollistaa uusien entsyymien löytämisen. Tosin jatkotutkimukset ovat vielä tarpeen mutanttien toiminnallisuuden varmistamiseksi.Description
Supervisor
Frey, AlexanderThesis advisor
Pásztor, AndrásKeywords
functional metagenomics, metagenome, mutation library, relaxed translation initiation, ribosomal protein S1