Production of antibody Fc fusion proteins by intein-mediated splicing
No Thumbnail Available
URL
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
School of Chemical Engineering |
Master's thesis
Checking the digitized thesis and permission for publishing
Instructions for the author
Instructions for the author
Authors
Date
2012
Department
Major/Subject
Bioprosessitekniikka
Mcode
Kem-70
Degree programme
Language
en
Pages
ix + 81 + [21]
Series
Abstract
Antibodies have become well-established therapeutic proteins and represent the fastest growing sector in the pharmaceutical industry. Novel antibody therapeutics has been generated, for example, by fusing antibody fragments to heterologous functional protein moieties. Traditionally, these fusion proteins have been produced by gene fusion methods. These methods, however, can be challenged by complexity of the molecule, often necessitating cloning and expression in a mammalian host. The use of mammalian hosts is expensive, time-consuming and technically challenging, and production needs to be optimized for every new protein. To address these difficulties, this thesis aimed, firstly, to develop a method for fusing antibody Fc (Fragment crystallisable) to diverse amino-terminal peptide moieties in vitro by protein trans-splicing. Protein trans-splicing is a posttranslational reaction in which two split intein halves associate and catalyse ligation of the flanking peptide sequences. This intein-mediated method could allow microbial protein expression, thus enabling the generation of antibody fusion proteins with lesser technological resources, time, and costs. Secondly, this thesis aimed to adopt Brevibacillus choshinensis as a shake flask-scale bacterial host for the expression of biologically relevant intein-Fc chimeras, and thirdly, apply the aforementioned methods to produce an antibody fusion protein targeted against human immunodeficiency virus (HIV). For HIV binding, the Fc of human immunoglobulin G1 was to be trans-spliced to a lectin protein scytovirin (SVN). This thesis project showed that the trans-splicing method was applicable in generating antibody fusion proteins. The tested intein-Fc constructs trans-spliced efficiently with heterologous aminoterminal moieties. Although the reaction required mild reducing conditions, gel electrophoresis and affinity to staphylococcal protein A suggested the disulphide-bonded antibody structure to have been preserved. B. choshinensis expressed the intein-Fc chimeras in a biologically active conformation, without undesirable posttranslational modifications, as confirmed by protein A affinity and mass spectrometry, respectively. However, the protein yields were low (1.3 mg/L of purified protein in a shake flask) and highly influenced by culturing conditions, requiring further optimization. The SVN-intein construct showed efficiency in trans-splicing although lacked the native, biologically active fold of SVN, as revealed by nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy.Vasta-aineita käytetään terapeuttisina proteiineina monien sairauksien hoidossa. Ne ovat nopeimmin kasvava sovellusalue lääketeollisuudessa. Vasta-ainemolekyyleja on muokattu uudenlaisiin terapeuttisiin sovelluksiin molekyylibiologisin menetelmin, esimerkiksi fuusioimalla vasta-aineiden osia muihin toiminnallisiin proteiiniosiin. Perinteisesti näitä fuusioproteiineja on tuotettu kimeeristen geenien avulla, mikä voi kuitenkin olla haastavaa molekyylin kompleksisuudesta johtuen. Molekyylin kompleksisuus edellyttää usein proteiinin tuottoa eläinsoluissa, mikä puolestaan on kallista, aikaa vievi3a ja teknisesti haastavaa. Lisaksi tuotto joudutaan optimoimaan jokaiselle uudelle proteiinille. Näiden haasteiden helpottamiseksi tässä työssä kehitettiin ensisijaisesti menetelmää vasta-aineen Fc (Fragment crystallizable) -osan liittämiseksi erilaisiin aminoterminaalisiin proteiiniosiin hyödyntäen proteiinien trans-silmukointia in vitro. Proteiinien trans-silmukointi on reaktio, jossa kaksi inteiinin puoliskoa yhdistyy ja katalysoi niihin liittyneiden peptidikeljujen yhdistämisen peptidisidoksella. Tämä inteiini-välitteinen menetelmä voisi mahdollistaa proteiinin tuoton mikrobi-isännässä, jolloin Fc-fuusioproteiini saataisiin tuotettua sovellustestaukseen nykyistä helpommin. Työn toisena ja kolmantena tavoitteena oli tuottaa inteiini-Fc-proteiineja Brevibacillus choshinensis -bakteerissa ravistelupulloissa ja käyttää edellä mainittuja menetelmiä ihmisen immuunikatovirusta (engl. human immunodeficiency virus, HIV) tunnistavan Fc-fuusioproteiinin tuottamiseen. HI-viruksen tunnistamiseksi Fc liitettiin sytoviriini-proteiiniin (engl. scytovirin, SVN) trans-silmukoinnin avulla. Tämä työ osoitti, että trans-silmukointi soveltuu Fc-fuusioproteiinien tuottamiseen. Työssä testatut inteiini-Fc-konstruktit silmukoituivat onnistuneesti erilaisten aminoterminaalisten proteiiniosien kanssa. Vaikka reaktio edellytti pelkistäviä olosuhteita, geelielektroforeesi ja sitoutuminen stafylokokkibakteerin proteiini A:han osoittivat vasta-aineen biologiselle aktiivisuudelle tärkeiden rikkisiltojen säilyneen. B. choshinensis tuotti inteiini-Fc-prekursorit kasvatusliuokseen biologisesti aktiivisessa muodossa, minkä osoitti sitoutuminen proteiini A:han. Ei-toivottujen translaation jälkeisten muokkausten puuttuminen varmennettiin massaspektrometrian avulla. Proteiinin saannot jäivät . kuitenkin alhaisiksi (1,3 mg/L puhdistettua proteiinia ravistelupullossa), ja kasvatusolosuhteiden huomattiin vaikuttavan merkittävästi proteiinin tuottoon, minkä vuoksi olosuhteiden lisäoptimointia suositellaan saannon parantamiseksi. SVN-inteiini-prekursori silmukoitui onnistuneesti, mutta SVN:n aktiivista rakennetta ei havaittu NMR-spektrissä.Description
Supervisor
Leisola, MattiThesis advisor
Iwai, HideoKeywords
antibody, vasta-aine, Fc, proteiinien trans-silmukointi, protein trans-splicing, inteiini, intein, sytoviriini, brevibacillus choshinensis, scytovirin