Development and validation of receptor-binding domain- and nucleoprotein-based fluorescent multiplex immunoassay (FMIA) to measure SARS-CoV-2 omicron variant-specific IgG antibodies

Loading...
Thumbnail Image
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Kemian tekniikan korkeakoulu | Master's thesis
Date
2023-12-12
Department
Major/Subject
Biotechnology
Mcode
CHEM3022
Degree programme
Master's Programme in Chemical, Biochemical and Materials Engineering
Language
en
Pages
53
Series
Abstract
The rapid global spread of SARS-CoV-2 raised the need for national COVID-19 detection through seroprevalence studies. Fluorescent multiplex immunoassay (FMIA) is a microsphere-based suspension assay that uses fluorescently activated microparticles to detect several analytes simultaneously. Recently an in-house FMIA was successfully set up and validated for serum IgG detection against wild-type SARS-CoV-2. However, the assay’s performance in recognising infections caused by new SARS-CoV-2 variants with an increasing number of mutations became a concern. The aim of this thesis was to further develop and validate the previously set up in-house SARS-CoV-2 FMIA for IgG detection against SARS-CoV-2 BA.1.1.529 Omicron variant and Omicron BA.5 subvariant RBD and N antigens. Optimal antigen concentrations for microsphere conjugation and an optimal serum starting dilution range were determined. The analytical performance was evaluated by investigating the possible cross-reactions between antigens and the precision of the assay. Precision was determined by studying intra- and inter-assay variation on the same and different days, as well as the variation caused by two batches of conjugated microspheres and two secondary antibody lots. The clinical performance was evaluated by determining thresholds for positivity and calculating clinical sensitivity and specificity for each antigen. No cross-reactivity was exhibited between SARS-CoV-2 Omicron antigens nor between Omicron variant and wild-type virus antigens. The intra- and inter-assay variation on the same day was 8-12% and 5-9%, respectively. The inter-assay variation between five days was 16-18%. Variation caused by different microsphere batches was 13-43% and 11-14% for two secondary antibody lots. Overall, the variation was acceptable, although different microsphere batches may cause variation in results. Excellent clinical specificity of 100% and a good clinical sensitivity of ≥88% was achieved for all Omicron and wild-type antigens. Next, the gained results should be compared to results from other serological assays, like microneutralization assay, to evaluate the capability of FMIA to predict the level of neutralizing antibodies.

SARS-CoV-2-viruksen nopea maailmanlaajuinen leviäminen synnytti tarpeen COVID-19 tautitapausten kansalliselle tunnistamiselle ja seroprevalenssitutkimukselle. Fluoresenssiin perustuvan helmipohjaisen immunokemiallisen menetelmän (FMIA) toiminta perustuu fluoresoituihin mikrohelmiin, joiden avulla voidaan samanaikasesti mitata usean eri analyytin pitoisuuksia. Aiemmin SARS-CoV-2 FMIA pystytettiin ja validoitiin tunnistamaan seeruminäytteiden SARS-CoV-2-viruksen villityypin IgG-vasta-aineita. Uusien SARS-CoV-2-virusvarianttien ilmaantuminen aiheutti kuitenkin huolen menetelmän kyvystä tunnistaa infektioita. Tämän diplomityön tavoitteena oli jatkokehittää ja validoida aiemmin pystytetty SARS-CoV-2 FMIA -menetelmä mittamaan SARS-CoV-2 BA.1.1.529 omikron-variantin ja omikronin BA.5 alavariantin resepetoriin sitoutuvan osan ja nukleoproteiinin tunnistavia IgG-vasta-aineita. Eri antigeenien optimaalinen konjugointipitoisuus ja seerumin aloituslaimennos määritettiin. Menetelmän analyyttistä toimintakykyä arvioitiin tutkimalla antigeenien mahdollista ristireagoivuutta sekä menetelmän täsmällisyyttä. Menetelmän täsmällisyys määritettiin tutkimalla tulosvaihtelua näytelevyjen sisäisesti ja niiden välillä saman päivän sisällä ja eri päivien välillä, sekä kahden eri mikrohelmi- ja sekundaarivasta-aineerän välillä. Menetelmän kliinistä toimintakykyä arvioitiin määrittämällä positiivisuuden rajat sekä menetelmän kliininen herkkyys ja spesifisyys eri antigeeneille. Ristireagoivuutta ei havaittu SARS-CoV-2 omikron-rakenteiden eikä omikron- ja villityyppirakenteiden välillä. Tulosvaihtelu oli 8-12% samalla levyllä ja 5-9% eri levyillä saman päivän sisällä sekä 16-18% eri levyillä viiden päivän välillä. Lisäksi vaihtelu oli 13-43% kahden eri mikrohelmierän ja 11-14% kahden eri sekundaarivasta-aineerän välillä. Tulosvaihtelu oli yleisesti ottaen hyväksyttävää, mutta eri mikrohelmierät voivat aiheuttaa vaihtelua. Menetelmälle todettiin erinomainen 100% spesifisyys sekä ≥88% herkkyys kaikille Omikron-variantti ja villityyppi antigeeneille. Seuraavaksi saatuja tuloksia tulisi verrata muiden serologisten menetelmien, esimerkiksi mikroneutralisaatiomenetelmän, tuloksiin ja tutkia FMIA-menetelmän kykyä tunnistaa neutraloivien vasta-aineiden määrää.
Description
Supervisor
Frey, Alexander
Thesis advisor
Melin, Merit
Solastie, Anna
Keywords
FMIA, nucleoprotein, omicron-variant, receptor-binding domain, SARS-CoV-2, validation
Other note
Citation