Biophysical characterization of non-hydrolytic fungal proteins
No Thumbnail Available
URL
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Kemian tekniikan korkeakoulu |
Master's thesis
Authors
Date
2021-06-14
Department
Major/Subject
Biosystems and Biomaterials Engineering
Mcode
CHEM3028
Degree programme
Master’s Programme in Life Science Technologies
Language
en
Pages
50 + 1
Series
Abstract
Phanerochaete carnosa is a white-rot fungus that expresses expansin-related proteins, which are expected to disrupt cellulose without hydrolyzing it. The hypothesis of the mechanics of expansins and expansin-related proteins is that they break the non-covalent bonds between molecules in the cell wall polysaccharide matrix. This allows the cellulose molecules to move past each other, while the cell wall stays intact. Expansins and related-proteins share key sequence and structural similarities. They are comprised of two distinct domains: a catalytic domain at the N-terminal (domain I), that adopts a double-psi-beta-barrel (DPBB) fold, and a putative polysaccharide binding domain (domain II) at the C-terminal, interconnected by a short linker section. However, expansin-related proteins from non-plant organisms called loosenins and loosenin-like proteins, contain only domain I. Loosenins are proven to have a disruptive effect on cellulose, suggesting that the beta-barrel structure is sufficient for non-hydrolytic action. Therefore, loosenins and loosenin-like proteins offer interesting opportunities in biomass processing. Untreated cellulose is relatively difficult to break down. Previous studies indicate that wood-based biomass may be more susceptible to hydrolyzing enzymes and modification after being treated with loosenins. This way, cellulose could be broken down and modified more easily while saving resources. Cellulose modification is crucial, for example, in the production of biofuels. To examine the observed function of the single DPBB containing domain of loosenin-like proteins, this thesis focuses on the study of specific conserved amino acids in their protein sequences. Two loosenin-like proteins representative of two different structural subgroups were chosen. From each protein of these proteins, three amino acids were mutated to alanine, resulting in six engineered variants in total. One variant of each protein was chosen to be expressed in Pichia pastoris, and the purified proteins were further biophysically characterized.Phanerochaete carnosa on valkolahosieni, joka tuottaa expansin-proteille (engl. expansin) sukua olevia proteiinia. Näiden proteiinien oletetaan hajottavan selluloosaa hydrolysoimatta sitä. Niiden uskotaan toimivan niin, että ne hajottavat soluseinän selluloosamatriisin molekyylien välisiä sidoksia, jotka eivät ole kovalenttisia. Ilman näitä sidoksia, selluloosamolekyylit pystyvät liikkumaan limittäin niin, että soluseinä ei hajoa. Expansineilla ja ja niille sukua olevilla proteiineilla on monia yhtäläisyyksiä sekä niiden sekvensseissä että rakenteissa. Ne koostuvat kahdesta domeenista: N-terminaalin katalyyttisestä domeenista (domeeni I), joka muodostaa laskoutuessaan tupla-psi-beta-tynnyrirakenteen (engl. double-psi-beta-barrel, DPBB}), ja C-terminaalin polysakkariideja sitovaksi oletetusta domeenista (domeeni II). Domeeneja yhdistää lyhyt linkkeriosio. Expansin-proteiineille sukua olevat loosenin-proteiinit (engl. loosenin) ja loosenin-proteiineille sukua olevat loosenin-like-proteiinit (engl. loosenin-like proteins) ovat ei-kasviperäisiä proteiineja, jotka sisältävät vain domeeni I:en. Loosenin-proteiinien on todistettu pystyvän muokkaamaan selluloosaa hydrolysoimatta sitä, joten voidaan olettaa, että beta-tynnyrin omaava domeeni I on riittävä tähän toimintaan. Tämän takia loosenin- ja loosenin-like-proteiinit tarjoavat mielenkiintoisia mahdollisuuksia biomassan työstämiseen. Käsittelemätöntä selluloosaa on vaikeaa muokata, ja aikaisempi tutkimus osoittaa, että selluloosa saattaa olla herkemmin altistuva hajottaville entsyymeille ja muokkaukselle loosenin -proteiineilla käsittelyn jälkeen. Tällaisen käsittelyn avulla selluloosaa voitaisiin hajottaa ja muokata helpommin ja säästää resursseja. Selluloosan muokkaus on tärkeää esimerkiksi biopolttoaineiden tuotannossa. Tämä diplomityö käsittelee loosenin-like-proteiinien sekvenssien konservoituneita aminohappoja, jotta yhden DPBB-rakenteen omaavan domeenin havaittua toimintaa voidaan tutkia. Kahta eri loosenin-like-proteiinien rakenteellista aliryhmää edustavaa proteiinia valittiin. Kuusi varianttia luotiin mutatoimalla molemmista proteiineista kolme aminohappoa alaniiniksi. Molemmista aliryhmistä valittiin lopuksi yksi variantti, josta tuotettiin proteiinia Pichia pastoris -soluissa. Puhdistettuja proteiineja karakterisoitiin edelleen biofyysisesti.Description
Supervisor
Master, EmmaThesis advisor
Ioannou, EleniKeywords
expansins, expansin-related proteins, loosenins, loosenin-like proteins, cellulose, biophysical characterization