Intracellular characterization of adhesive protein condensation

No Thumbnail Available
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Kemian tekniikan korkeakoulu | Master's thesis
Date
2023-08-21
Department
Major/Subject
Biosystems and Biomaterials Engineering
Mcode
CHEM3028
Degree programme
Master’s Programme in Life Science Technologies
Language
en
Pages
91+5
Series
Abstract
This thesis aims to characterize the intracellular behaviour of MFP-fusion proteins and investigate whether this behaviour correlates with their extracellular behaviour. Various methods were utilised to analyse the expressed proteins. In the intracellular context, microscopy, SDS-page gels, FRAP, and spectrophotometry were used to visualize and characterize protein behaviour. The proteins were also studied in different extracellular environments, such as varying pH, temperature, salt, and protein concentrations, using microscopy. Additionally, adhesion properties of one protein were tested. The proteins were grouped based on their in vivo appearance, first according to behaviour after 20 hours of expression and then further into subgroups according to behaviour at 3 hours. The proteins showing full condensation after 20 hours of expression became the focus of this thesis, as it is potentially indicative of liquid-liquid phase separation (LLPS). After each analysis method, proteins less likely to undergo LLPS were eliminated, resulting in the selection of four proteins: eGFP-RGG-mfp3-st, eGFP-NT*-mfp3-st, eGFP-mfp3-barnacle, and eGFP-NT-mfp3-CT. The three first mentioned proteins showed signs of LLPS in vitro, although their reproducibility varied. The first two be-longed to the group that showed partial condensation after 3 hours of expression, followed by complete condensation after 20 hours, while the third one exhibited partial condensation only after 20 hours of expression. Thus, partial condensation in vivo at some point appeared to be a key factor for LLPS in vitro. To establish a correlation between in vivo and in vitro behaviour, crowding agents were used to mimic crowded intracellular conditions. However, the crowding agent played a significant role in determining adhesion properties, suggesting the need to find LLPS conditions without crowding agents for subsequent mechanical testing. Given the small sample size studied in this thesis, further investigation of proteins belonging to other groups is necessary before drawing definitive conclusions. These findings could suggest implications for understanding protein behaviour in vivo, its correlation to in vitro behaviour, and the potential utilization of these proteins as adhesives.

Denna avhandling syftar till att karaktärisera det intracellulära beteendet hos MFP-fusionsproteiner och undersöka ifall detta beteende korrelerar med proteinernas extracellulära beteende. Olika metoder användes för att analysera proteinerna. Inom den intracellulära kontexten användes mikroskopi, SDS-page-geler, FRAP och spektrofotometri för att visualisera och karaktärisera proteinbeteendet. Proteinerna studerades också i olika extracellulära förhållanden, såsom varierande pH, temperatur, salt- och protein-koncentrationer, med hjälp av mikroskopi. Dessutom testades häftningsegenskaper hos ett av proteinerna. Proteinerna grupperades i olika grupper först enligt sitt utseende in vivo efter 20 timmars uttryck och därefter enligt utseendet efter 3 timmar. Undersökning av de proteiner som visade fullständig kondensation efter 20 timmar prioriterades inom avhandlingen. Efter varje analysmetod eliminerades proteinerna som med mindre sannolikhet kommer att genomgå LLPS, vilket resulterade i urvalet av fyra proteiner: eGFP-RGG-mfp3-st, eGFP-NT*-mfp3-st, eGFP-mfp3-barnacle och eGFP-NT-mfp3-CT. De tre förstnämnda proteinerna visade tecken på LLPS in vitro, även om deras reproducerbarhet varierade. De två första av dessa tre proteiner tillhörde gruppen som visade partiell kondensation efter 3 timmars uttryck och sedan fullständig kondensation efter 20 timmar, varav den tredje visade partiell kondensation först efter 20 timmars uttryck. Därmed tycks partiell kondensation in vivo vid någon tidpunkt vara en nyckelfaktor för LLPS in vitro. För att fastställa en korrelation mellan beteendet in vivo och in vitro tillsattes ämnen som hade en undanträngande effekt, för att efterlikna det trånga intracellulära förhållandet. Dock spelade dessa ämnen en betydande roll vid bestämningen av häftningsegenskaperna, vilket antyder behovet av att hitta LLPS-förhållanden utan dessa ämnen ifall tester av mekaniska egenskaper eventuellt vill utföras. Med tanke på den lilla provstorleken som undersöktes i denna avhandling krävs ytterligare undersökning av proteiner som tillhör även andra grupper innan definitiva slutsatser kan dras. Dessa fynd kan däremot ha betydelse för att förstå proteinbeteende in vivo, dess korrelation till beteende in vitro och möjligheten att använda dessa proteiner som adhesiver.
Description
Supervisor
Linder, Markus
Thesis advisor
Feng, Jianhui
Keywords
intracellular behaviour, LLPS, protein condensation, MFP, fusion protein, adhesive protein
Other note
Citation