Entsymaattisen hydrolyysin tehostamiskeinot - korkean lämpötilan esihydrolyysit selluloosamateriaaleilla

No Thumbnail Available
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Kemian tekniikan korkeakoulu | Master's thesis
Date
2014-06-23
Department
Major/Subject
Biotekniikka ja elintarviketekniikka
Mcode
KE3002
Degree programme
KEM - Kemian tekniikan koulutusohjelma
Language
fi
Pages
137 + 10
Series
Abstract
Metsäteollisuuden sivutuotteet tarjoavat ekologisen raaka-aineen uuden sukupolven bioetanolille. Samalla pohjoismainen havupuu on kuitenkin yksi vaikeimmin prosessoitavista selluloosamateriaaleista, minkä vuoksi uusien prosessireittien etsiminen on välttämätöntä. Tämän diplomityön tavoitteena oli tehostaa höyryräjäytetyn kuusen entsyymihydrolyysiä termostabiileilla selluloosaa hajottavilla endoglukanaasi- ja hemisellulaasientsyymeillä. Painopiste oli erityisesti lyhyiden viipymäaikojen sekä korkean lämpötilan ja kiintoainepitoisuuden esihydrolyyseissä. Kirjallisuusosassa käydään läpi yleisimmät lignoselluloosan esikäsittelymenetelmät ja perustellaan ääriolosuhteiden, kuten korkean lämpötilan, käyttämistä osana entsyymikäsittelyjä. Lisäksi kirjallisuuskatsauksessa esitellään lupaavia termostabiileja sellulaaseja, arvioidaan niiden selluloosaan sitoutuvan osan (carbohydrate binding module, CBM) roolia sekä käsitellään keinoja, joilla hydrolyysissä tarvittavaa entsyymiannostusta pystytään vähentämään. Kokeellisessa osassa tuotettiin ja karakterisoitiin kirjallisuuden avulla valikoituja termostabiileja Pyrococcus horikoshii ja Thermoascus aurantiacus endoglukanaaseja. Parhaat variantit valittiin edelleen höyryräjäytetyn kuusipurun esihydrolyyseihin, joissa endoglukanaasien ohella käytettiin myös hemisellulaaseja. Kokeissa tarkkailtiin erityisesti korkean lämpötilan ja CBM:n merkitystä. Tuotetuista endoglukanaaseista lupaavin oli P. horikoshii EG (PHc), jonka optimilämpötilaksi määritettiin 100 °C. PHc:llä suoritetuissa kiteisen selluloosan hydrolyyseissä jatkuva sekoitus paransi hydrolyysiä 70 °C:ssa 70 %, kun taas 100 °C:ssa hydrolyysi oli käytännössä riippumaton sekoituksesta. Vastaavasti CBM:n merkitys korostui ilman sekoitusta, jolloin se lähes kaksinkertaisti P. horikoshii EG:n kiteisen selluloosan hydrolyysitehokkuuden. Kuusipurun esihydrolyyseissä CBM:llä ei kuitenkaan havaittu olevan merkitystä P. horikoshii EG:n tehokkuudelle. Esitettyjen tulosten mukaan CBM:stä on hyötyä vain alhaisissa kiintoainepitoisuuksissa lähes puhtaasti selluloosasta koostuvilla materiaaleilla. Korkean lämpötilan tuomat edut sitä vastoin säilyivät myös kuusipurun esihydrolyyseissä. 100 °C:n PHc-esihydrolyysi paransi höyryräjäytetyn kuusen hydrolyysiastetta 15–30 %, kun taas 80 °C:ssa vaikutus jäi noin kolmannekseen tästä. Vastaavasti 80 °C:n hemisellulaasikäsittely paransi kuusipurun hydrolyysiastetta 20–33 % ja peräkkäisillä apuentsyymikäsittelyillä vaikutus oli jopa 50–70 %. Näiden esihydrolyysien vaikutusta voitiin edelleen lisätä erillisellä prosessivaiheella, jossa materiaali pestiin kuumalla vedellä hemisellulaasikäsittelyn jälkeen. Esihydrolyysien tuoma etu oli selkeästi nähtävissä myös korkealla kaupallisen entsyymivalmisteen määrällä (30 FPU/g ka.), vaikkakin edun suhteellinen merkitys väheni. Esihydrolyysien avulla höyryräjäytetyn kuusen kokonaishydrolyysiaste oli parhaimmillaan 56 %.

Residues from forest industry provide an ecologically sustainable raw material for the next generation bioethanol. At the same time, Nordic softwoods are one of the most recalcitrant materials to process which creates a demand for new process configurations. The aim of this thesis was to improve the enzymatic hydrolysis of steam pretreated (steam explosion) spruce by utilizing thermostable endoglucanases and hemicellulases. The focus was especially on short prehydrolysis residence times performed at high temperature and high raw material consistency. Literature survey focuses on the most common pretreatment technologies and methods for conducting enzymatic hydrolysis at extreme conditions, such as high temperature. Furthermore, some promising thermostable cellulases are introduced and the role of CBM (carbohydrate binding module) is discussed. Moreover, an overview concerning the methods for reducing the enzyme dosage is presented. In the experimental part thermostable Pyrococcus horikoshii and Thermoascus aurantiacus endoglucanases were produced and characterized. The most promising variants were selected for the prehydrolysis experiments of steam pretreated spruce together with the hemicellulases. The focus of these experiments was to study the importance of high temperature and CBM. The most promising endoglucanase was P. horikoshii EG (PHc), which had a temperature optimum of 100 °C. When crystalline cellulose was hydrolyzed with PHc, the addition of continuous mixing improved the hydrolysis by 70 % at 70 °C whereas at 100 °C no improvement was observed. Moreover, the importance of CBM was especially obvious without mixing, in which case it almost doubled the hydrolytic activity of P. horikoshii EG towards crystalline cellulose. However, CBM was irrelevant when concerning the hydrolytic efficiency of P. horikoshii EG towards pretreated spruce. It is likely that CBM improves hydrolysis only at low solids content and with materials containing mainly pure cellulose. Nevertheless, the benefits of high temperature remained evident also in the prehydrolysis experiments of spruce. At 100 °C the PHc-prehydrolysis improved the hydrolysis yield by 15–30 % whereas at 80 °C the improvement was approximately 3-fold less. Moreover, hemicellulase treatment at 80 °C improved the yield by 20–33 % and the combined treatment with all accessory enzymes by 50–70 %. The effect of these prehydrolysis steps could be further improved by additional process step, where the material was washed with hot water after the hemicellulase treatment. Benefits gained through these prehydrolysis steps remained evident even when a high dosage (30 FPU/g DM) of commercial enzyme preparation was used although the relative importance decreased. With the aid of these prehydrolysis steps, 56 % total hydrolysis yield of pretreated spruce was achieved.
Description
Supervisor
Ojamo, Heikki
Thesis advisor
Turunen, Ossi
Keywords
Pyrococcus horikoshii, Thermoascus aurantiacus, endoglukanaasi, hemisellulaasi, CBM, entsymaattinen esihydrolyysi, korkea lämpötila ja kiintoainepitoisuus, höyryräjäytetty kuusi, Pyrococcus horikoshii, Thermoascus aurantiacus, endoglucanase, hemicellulase, CBM, enzymatic prehydrolysis, high temperature and consistency, steam pretreated spruce
Other note
Citation