Evolutionary adaptation of engineered yeast strains
Loading...
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Kemian tekniikan korkeakoulu |
Master's thesis
Unless otherwise stated, all rights belong to the author. You may download, display and print this publication for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Author
Date
2024-06-11
Department
Major/Subject
Biotechnology
Mcode
CHEM3022
Degree programme
Master's Programme in Chemical, Biochemical and Materials Engineering
Language
en
Pages
57
Series
Abstract
Industrial biosynthesis processes provide an excellent alternative to oil-based chemical produc-tion, as they could be used to convert renewable resources to a large variety of compounds. These biosynthesis processes, however, commonly use microbial cells expressing engineered production pathways. The engineered production pathways tend to compromise the fitness of cells. Thus, the population of cells is prone to losing the production efficiency in long term cultiva-tion, as natural selection favours high fitness individuals. Therefore, tracking and characterizing the evolutionary stability of an engineered pathways is especially important for long-term industrial applications, where the unexpected loss of production efficiency can cripple the whole production process. The aim of this work was to assess the evolutionary stability of production traits engineered in yeast Saccharomyces cerevisiae strains. The strains were exposed to adaptive laboratory evolution (ALE). The yeast strains included haploid and diploid indigoidine pigment producing strains, as well as their corresponding wild type strains. Additionally, haploid bikaverin pigment producing strain was also used as a comparison point to the indigoidine strains. These strains were adaptively evolved in four lineages in both rich and synthetic defined media. During the ALE, the haploid lineages were adapted for approximately ~200 generations, while the diploid lineages were adapted for ~120 generations. The growth rates and pigment production of the S. cerevisiae lineages were tracked during the ALE, as the data they provided could be used to assess the stability of the engineered production traits. Growth rates of all yeast strains were determined at the start of the ALE and the growth rates of the adapted lineages were assessed at the end of the ALE. The growth rates of the adapted lineages were generally found to improve notably during the ALE, as on average, the adapted lineages experienced growth rate increase of 30%. The pigment production of the engineered lineages was tracked by plating a set amount of their diluted broth cultures onto solid rich media plates at predetermined time points. These plates were then used to count the proportion of pigment producing clones for each of the producing lineages. All the haploid indigoidine lineages lost their pigmentation completely after ~200 generations of adaptation, while the diploid indigoidine lineages lost over 80% of their pigmentation after ~120 generations. The haploid bikaver-in lineages were surprisingly robust, as their rich media grown lineages lost only 63% of their pigmentation after ~200 generations, while two of the synthetic defined medium grown lineages did not lose any pigmentation during the ALE. Knowledge on the evolutionary stability of an engineered pathway is important, as it can di-rectly affect the production yield of biosynthesis processes. Stabilizing production yields can improve the economic feasibility of these processes, which is important when we are aiming for more sustainable and oil-free future.Teolliset biosynteesiprosessit tarjoavat erinomaisen vaihtoehdon öljypohjaiselle kemikaalien tuotannolle, johtuen mahdollisuudesta tuottaa monenlaisia yhdisteitä uusiutuvista resursseista. Näissä biosynteesiprosesseissa käytetään kuitenkin usein mikrobisoluja, joihin on viety heteroloogisia tuotantoreittejä. Heteroloogiset tuotantoreitit saattavat merkittävästi heikentää solujen elinvoimaisuutta, mikä voi johtaa odottamattomiin muutoksiin pitkäkestoisissa tuotantoprosesseissa. Luonnonvalinnan takia muunnellut mikrobikannat, ovat alttiita menettämään niihin kehitettyjen tuotantoreittien tehokkuutta. Siksi tuotantoreittien evoluutionäärisen stabiiliuden seuraaminen ja arvioiminen on tärkeää etenkin pitkänajan teollisissa käyttökohteissa, joissa odottamaton tuotan-toreitin heikentyminen voi rampauttaa koko prosessin. Tämän työn tavoitteena oli arvioida muunneltujen Saccharomyces cerevisiae-hiivakantojen tuotanto-ominaisuuksien evoluutionääristä stabiiliutta. Hiivakannat altistettiin adaptiiviselle laboratorioevoluutiolle (ALE). Hiivakannat sisälsivät indigoidine pigmenttiä tuottavat haploidi- ja diploidikannat, sekä näiden villityypit. Näiden ohella, bikaverin pigmenttiä tuottavaa haploidikantaa käytettiin vertailukohteena indigoidinea tuottaville kannoille. Näitä hiivakantoja kasvatettiin, sekä rikkaassa, että synteettisessä määritellyssä kasvatusalustassa, joissa molemmissa kaikilla hiivakannoilla oli neljä sukulinjaa. ALE:ssa haploidisukulinjoja kasvatettiin arviolta ~200 sukupolven ajan, kun taas diploidisukulinjoja adaptoitiin noin ~120 sukupolven ajan. Sukulinjojen kasvunopeuksia ja pigmenttien tuotantoa seurattiin ALE:n aikana, sillä näitä seuraamalla kantoihin kehitettyjen tuotanto-ominaisuuksien stabiiliutta pystyttiin arvioimaan. Kaikkien hiivakantojen kasvunopeudet määritettiin sekä ALE:n alussa, että lopussa. Evolvoitujen kantojen kasvunopeudet kehittyivät keskimäärin 30% ALE:n aikana. Muunneltujen kantojen pigmenttituotantoa seurattiin levittämällä sukulinjojen laimennettua viljelmää petrimaljoille ennalta määrättyinä ajankohtina. Petrimaljojen inkubaation jälkeen, maljoilta pystyttiin laskemaan pigmenttiä tuottavien kloonien osuus jokaisessa sukulinjassa. Kaikki indigoidine pigmenttiä tuottavat haploidisukulinjat menettivät värityksensä kokonaan ~200 sukupolven kasvatuksen jälkeen. Diploidisukulinjat puolestaan menettivät yli 80% niiden värityksestä ~120 sukupolven jälkeen. Haploidit bikaverin pigmenttiä tuottavat sukulinjat kykenivät säilyttämään värityksensä yllättävän hyvin. Rikkaassa kasvatusalustassa kasvaneet sukulinjat menettivät vain 63% niiden värityksestä ~200 sukupolven kasvatuksen jälkeen. Puolet synteettisessä määritellyssä kasvatusalustassa kasvaneista sukulinjoista eivät menettäneet väritystä ollenkaan ALE:n aikana. Tieto muunneltujen hiivakantojen tuotantoreittien evoluutionäärisestä stabiiliudesta on tär-keää, sillä se vaikuttaa suoraan biosynteesiprosessien tuotannon saantoihin. Tuotannon stabiloiminen parantaa biosynteesiprosessien taloudellista kannattavuutta, mikä on tärkeää kestävän ja öljyvapaan tulevaisuuden saavuttamiseksi.Description
Supervisor
Jouhten, PaulaThesis advisor
de Lucena Antunes, DiogoKeywords
adaptive laboratory evolution, heterologous expression stability, microbial evolution, Saccharomyces cerevisiae
