Strep-tag based method for protein quantification

No Thumbnail Available
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Kemian tekniikan korkeakoulu | Master's thesis
Date
2024-01-23
Department
Major/Subject
Biotechnology
Mcode
CHEM3022
Degree programme
Master's Programme in Chemical, Biochemical and Materials Engineering
Language
en
Pages
51
Series
Abstract
Protein quantification is the base for protein analysis. As understanding of proteins is essential in numerous different fields, they are heavily studied. There are a lot of different quantification methods that either analyse the total protein or a specific protein content of a sample. However, no method is suitable for all types of protein samples, as each assay has their own requirements, advantages and challenges. This thesis focuses on the quantification of a specific protein using a peptide tag called Strep-tag. This new form of protein quantification is based on a western blot assay coupled with radioactive detection and it has been tested with silk-like proteins. The silk-like recombinant proteins containing a Strep-tag in their N-terminus were expressed in Escherichia coli. They were purified using affinity chromatography and quantified using Strep-Tactin, a ligand, which binds specifically and with high affinity to a Strep-tag present in studied proteins. Strep-Tactin has been modified to contain a radioactive tritium label, the decay of which is measured at the final stage of the assay using liquid scintillation counting. The radioactivity measured is proportional to the protein concentration of the sample. The aim of this thesis was to improve and optimize this method, as it was relatively new. In addition to making sure the protocol steps worked as intended, protein detection limits were determined and different forms of Strep-tags and Strep-Tactins were compared to find the superior combination. This quantification method has shown great potential by producing results with high accuracy faster than other common methods in the field.

Proteiinikonsentraation määritys on proteiinianalyysin perusta. Koska proteiinien ymmärtäminen on välttämätöntä lukuisilla eri tieteenaloilla, niitä tutkitaan paljon. On olemassa lukuisia erilaisia konsentraation määritysmenetelmiä, jotka analysoivat joko proteiininäytteen kaikki proteiinit tai keskittyvät vain yhteen tiettyyn proteiiniin. Ei ole kuitenkaan yhtä menetelmää, joka soveltuisi kaikentyyppisille proteiininäytteille, sillä jokaisella tekniikalla on omat vaatimuksensa, hyötynsä ja haasteensa. Tämä diplomityö keskittyy yhden proteiinin määrittämiseen liuoksesta käyttäen Strep-tag-nimistä peptiditagia apunaan. Tämä uusi määritysmenetelmä perustuu western blot -tyyppiseen analyysiin, jossa lopullinen proteiinien havaitseminen tapahtuu radioaktiivisen mittauksen avulla. Tämän menetelmän kehityksessä on käytetty silkkiproteiineja. Silkinkaltaisia rekombinanttiproteiineja, jotka sisälsivät Strep-tagin N-terminaalissaan, tuotettiin Escherichia coli -bakteerissa. Nämä proteiinit eristettiin liuoksesta käyttäen affiniteettikromatografiaa ja niiden konsentraatio määritettiin käyttäen Strep-Tactin-nimistä ligandia, joka sitoutuu spesifisesti suurella affiniteetilla tarkasteltujen proteiinien Strep-tagiin. Strep-Tactinia oltiin muokattu sisältämään tritiumleima, jonka radioaktiivista hajoamista mitattiin menetelmän lopussa käyttäen nestetuikelaskentaa. Mitattu radioaktiivisuus on verrannollinen proteiininäytteen konsentraatioon. Tämän diplomityön tavoitteena oli kehittää ja optimoida tätä menetelmää, koska se on suhteellisen uusi. Sen lisäksi, että protokollan päävaiheiden toimivuus varmistettiin, myös proteiinin toteamisraja ja erilaisten Strep-tagien ja Strep-Tactinien ideaali yhdistelmä selvitettiin. Tämä määritysmenetelmä on osoittanut suurta potentiaalia tuottaessaan tarkkoja tuloksia nopeammin kuin muut yleisesti käytetyt menetelmät.
Description
Supervisor
Linder, Markus
Thesis advisor
Malkamäki, Maaria
Keywords
strep-tag, strep-tactin, protein quantification, liquid scintillation counting, tritium
Other note
Citation