Development of tools for intracellular pH measurement in yeast and fungi

Simple item page
dc.contributorAalto-yliopistofi
dc.contributorAalto Universityen
dc.contributor.advisorValkonen, Mari 
dc.contributor.authorKaija, Jenni
dc.contributor.departmentBiotekniikan ja kemian tekniikan laitosfi
dc.contributor.schoolKemian tekniikan korkeakoulufi
dc.contributor.schoolSchool of Chemical Engineeringen
dc.contributor.supervisorLeisola, Matti 
dc.date.accessioned2020-12-23T17:27:16Z
dc.date.available2020-12-23T17:27:16Z
dc.date.issued2011 
dc.description.abstractThe aim of this work was to optimize tools for intracellular pH (pH<sub>i</sub>) measurement in yeast Saccharomyces cerevisiae and filamentous fungus Trichoderma reesei using genetically encoded ratiometric pH probes, pHluorin and RaVC. The pH probe was expressed in control strains and strains that are known to produce different acids in the culture medium: in a S. cerevisiae D-xylonate producing strain, a T. reesei L-galactonate producing strain and a T. reesei 2-keto-3-deoxy-L-galactonate producing strain. Measurement of the pHi was done with living cells using two in vivo methods: imaging and measuring the cytoplasmic pH of single cells using a standard fluorescence microscope (FM), and measuring the cytoplasmic pH of the cell populations using a spectrofluorometer (SFM). It has been shown that the acids accumulate in the cytoplasm and in this work it was studied, if there were differences in cytoplasmic pH in acid producing and control strains. The method measuring pH<sub>i</sub> with the FM could be optimized to the level that the pH could be measured. Better accuracy was achieved with the spectrofluorometric method which worked well with S. cerevisiae strains. The pK<sub>a</sub> value of RaVC measured with the FM was 7.0±0.2. The pK<sub>a</sub> value of pHluorin measured with the FM was 7.3±0.1 and with the SFM 7.1±0.1. The excitation maxima of pHluorin were measured with the SFM to be 395 and 475 nm. The pH<sub>i</sub> values of the strains were measured without inducing acid production. The pH<sub>i</sub> of the S. cerevisiae control strain was 6.4±0.5 and the pH<sub>i</sub> of D-xylonate producing strain was 6.6±0.5 when measured with the FM and respectively, 6.9±0.2 and 6.9±0.1 when measured with the SFM. The results indicated that there are no differences between the strains when grown under conditions where there is no intracellular accumulation of D-xylonate in the D-xylonate producing strain. The pH<sub>i</sub> of the T. reesei control strain was 7.0±0.3 when measured with the FM. The pH<sub>i</sub> of T. reesei has not been published earlier. Other constants and pH<sub>i</sub> values corresponded to values in the literature. In order to measure pH<sub>i</sub>, different cultivations were conducted in conditions that induced acid production in D-xylonate and L-galactonate producing strains. The results indicate that the pH<sub>i</sub> decreases slightly when the acid accumulates in the cells. The measurement samples in the production conditions proved to be difficult to analyse, although the methods could be optimized. Variation of the results between the FM and the SFM can be explained by the different measurement techniques, the different characters of the measurement values and the behaviour of the pH probe in the measurement samples.en
dc.description.abstractTämän työn tarkoitus oli optimoida Saccharomyces cerevisiae -hiivan ja Trichoderma reesei -homeen solunsisäisten pH-arvojen (pH<sub>i</sub>) mittausmenetelmiä käyttäen geneettisesti koodattuja pH-koettimia, pH luorinia ja Ra VC:ta. pH-koetin ilmennettiin kontrollikannoissa ja kannoissa, joiden tiedetään tuottavan erilaisia happoja kasvatusalustaan: D-ksylonaattia tuottavassa S. cerevisiae -hiivakannassa, L-galaktonaattia tuottavassa T. reesei -homekannassa ja 2-keto-3-deoksi-L-galaktonaattia tuottavassa T. reesei -homekannassa. pH<sub>i</sub>-arvon mittaus tehtiin elävissä soluissa käyttäen kahta in vivo -menetelmää: yksittäisten solujen kuvantaminen ja soluliman pH-arvon mittaaminen käyttäen fluoresenssimikroskooppia (FM) sekä solupopulaatioiden soluliman pH-arvon mittaaminen käyttäen spektrofluorometriä (SFM). On osoitettu, että hapot kerääntyvät solulimaan ja tässä työssä haluttiin tutkia, oliko happoa tuottavien ja kontrollikantojen soluliman pH-arvoissa eroja. Solunsisäisen pH-arvon mittausmenetelmä FM:lla pystyttiin optimoimaan tasolle, jotta pH<sub>i</sub>-arvo pystyttiin mittamaan. Parempi tarkkuus saavutettiin SFM-menetelmällä, joka toimi hyvin S. cerevisiae -kannoilla. FM:lla mitattu RaVC:n pK<sub>a</sub>-arvo oli 7,0±0,2. FM:lla mitattu pHluorinin pK<sub>a</sub>-arvo oli 7,3±0,1 ja SFM:llä mitattu arvo oli 7,l±0,1. SFM:llä mitatut pHluorinin eksitaatiohuiput olivat 395 ja 475 nm. Kantojen pH<sub>i</sub>-arvot mitattiin ilman hapon tuoton indusoimista. S. cerevisiae -hiivan kontrollikannan pH<sub>i</sub>-arvo oli 6,4±0,5 ja D-ksylonaattia tuottavan kannan pH<sub>i</sub>-arvo oli 6,6±0,5 mitattuna FM:lla ja vastaavasti 6,9±0,2 ja 6,9±0,1 mitattuna SFM:llä. Tulokset viittasivat siihen, että kantojen välillä ei ollut eroja, kun kasvatusolosuhteet olivat sellaiset, että D-ksylonaattia ei kertynyt solunsisäisesti sitä tuottavassa kannassa. T.reesei -homeen kontrollikannan pH<sub>i</sub>-arvo oli 7,0±0,3 mitattuna FM:lla. T.reesei -homeen pH<sub>i</sub>-arvoa ei ole julkaistu aikaisemmin. Muut vakiot ja pH<sub>i</sub>-arvot vastasivat kirjallisuusarvoja. Erilaisia kasvatuksia tehtiin pH<sub>i</sub>-arvon mittaamista varten kasvatusoloissa, jotka käynnistivät hapon tuoton D-ksylonaattia ja L-galaktonaattia tuottavissa kannoissa. Tulokset viittasivat siihen, että pH<sub>i</sub>-arvo laskee, kun happoa kertyy soluihin. Mittausnäytteet tuotto-olosuhteissa osoittautuivat vaikeaksi analysoida, vaikka menetelmät pystyttiin optimoimaan. Tulosten vaihtelu FM- ja SFM-menetelmien välillä voidaan selittää erilaisilla mittaustekniikoilla, erilaisilla mittausarvojen luonteilla sekä pH-koettimen käyttäytymisellä mittausnäytteissä.fi
dc.format.extentvii + 74 + [4] 
dc.identifier.urihttps://aaltodoc.aalto.fi/handle/123456789/99337
dc.identifier.urnURN:NBN:fi:aalto-2020122358164
dc.language.isoenen
dc.programme.majorBioprosessitekniikkafi
dc.programme.mcodeKem-70fi
dc.rights.accesslevelclosedAccess
dc.subject.keywordintracellular pHen
dc.subject.keywordsolunsisäinen pHfi
dc.subject.keywordsaccharomyces cerevisiaeen
dc.subject.keywordfluoresenssimikroskopiafi
dc.subject.keywordtrichoderma reeseien
dc.subject.keywordspektrofluorometriafi
dc.subject.keywordfluorescence microscopyen
dc.subject.keywordratiometrinen koetinfi
dc.subject.keywordspectrofluorometryen
dc.subject.keywordpHluorinfi
dc.subject.keywordratiometric probeen
dc.subject.keywordRaVCfi
dc.subject.keywordpHluorinen
dc.subject.keywordD-ksylonaattifi
dc.subject.keywordD-xylonateen
dc.subject.keywordL-galaktonaattifi
dc.subject.keywordL-galactonateen
dc.titleDevelopment of tools for intracellular pH measurement in yeast and fungien
dc.titleHiivan ja homeiden solunsisäisten pH-arvojen mittausmenetelmien kehitysfi
dc.type.okmG2 Pro gradu, diplomityö 
dc.type.ontasotMaster's thesisen
dc.type.ontasotPro gradu -tutkielmafi
dc.type.publicationmasterThesis 
local.aalto.digiauthask
local.aalto.digifolderAalto_69167
local.aalto.idinssi42606
local.aalto.openaccessno
Files
Collections
[dipl] Kemian tekniikan korkeakoulu / CHEM