Use of metal ions for linker cleavage in fusion proteins

Abstract

Työn kirjallisuusosassa on tarkasteltu fuusioproteiineja sekä fuusioproteiinitekniikan tarjoamia hyötyjä rekombinanttiproteiinien tuotossa. Fuusioproteiinien kemiallisia ja entsymaattisia katkaisumenetelmiä on tarkasteltu yksityiskohtaisesti. Kirjallisuusosassa on myös perehdytty kupari-ionien rooliin luonnossa. Metalli-ionien osallistumisesta proteiinien degradaatioon on kerrottu sekä tämän hetkiset tutkimustulokset kupari-ionien sekä rautakelaattien avulla tapahtuvasta proteiinien spesifisestä pilkkomisesta on esitelty.

Työn kokeellisessa osassa tutkittiin kupari(II)ionilla tapahtuvaa fuusioproteiinin peptidiketjun katkeamisreaktiota. Fuusioproteiinin katkeaminen kahteen fuusioproteiinipartnereiden kokoa vastaaviin fragmentteihin saavutettiin kupari(II)ionin, askorbaatin sekä vetyperoksidin avulla noin tunnin inkuboinnilla. Reaktio-olosuhteiden vaikutusta katkaisureaktioon tutkittiin. Katkaisureaktion tehokkuutta sekä spesifisyyttä pystyttiin parantamaan vaihtelemalla pH:ta, puskuria, reaktiolämpötilaa, reaktioaikaa sekä suola-, kupari(II)ioni- ja vetyperoksidikonsentraatioita. Katkaisureaktion todettiin olevan nopea ja korkealla reaktiolämpötilalla oli reaktiota kiihdyttävä vaikutus. Reaktioliuoksen suolapitoisuus paransi olennaisesti reaktion spesifisyyttä. Katkaisureaktion saannon todettiin olevan heikko eikä sitä olosuhteiden parantelusta huolimatta pystytty olennaisesti parantamaan.

Katkaisureaktion tarkka katkeamiskohta selvitettiin. Katkeamistuotteet erotettiin kromatografisesti ja niiden N-terminaalinen sekvenssi sekä molekyylipaino määritettiin. Katkeamisreaktiossa todettiin 73,2 kDa fuusioproteiinin pilkkoutuneen 31,2 ja 41,9 kDa fragmenteiksi ja katkaisureaktion todettiin olevan spesifinen peptidilinkkerin histidiinialueelle. Fuusioproteiinin N-terminaalisen katkeamistuotteen sekä katkeamattoman fuusioproteiinin N-terminukset olivat vahingoittumattomat. C-terminaalisen katkeamistuotteen N-terminaalista sekvenssiä ei saatu selville, johtuen todennäköisesti vapaan aminoryhmän puuttumisesta tai heterogeenisesta N-terminuksesta. Puhtaan fuusioproteiinin molekyylipainon todettiin olevan oletettua pienempi ja virhe fuusioproteiinin geenissä tai proteiinin katkeaminen läheltä C-terminusta fuusioproteiinin tuotossa osoittautui mahdolliseksi.

Kokeellisessa osassa tutkittu ilmiö on ollut tunnettu jo aiemmin, mutta sen spesifisyyttä ei ole aiemmin yritetty parantaa proteiinin muokkauksella. Nyt proteiinin spesifinen katkeaminen saavutettiin fuusioproteiiniin suunnitellusta erityisestä katkaisukohdasta. Kupari-ionien aiheuttama degradaatio pystyttiin ohjaamaan haluttuun kohtaan proteiinia histidiinijakson avulla.