Analysing p53-gene mutations: Comparison of capillary SSCP method with DGGE method and direct sequencing

Abstract

Geenien toimintaa muuttavien pistemutaatioiden tunnistamisesta on tullut yhä tärkeämpää biologisessa tutkimuksessa. Yksi tärkeimpiä tutkimusalueita on syöpätutkimus, jossa pyritään selvittämään miten mutaatiot vaikuttavat syövän kehitykseen. On osoitettu, että useissa ihmisen syövissä tapahtuva p53-kasvurajoitegeenin mutatoituminen on keskeisessä osassa syövän kehitystä. p53-kasvurajoitegeenin eri mutaatiotyyppien ja niiden kerääntymisen tietyille alueille uskotaan voivan viitata mutaatiot aiheuttaneisiin altisteisiin.

Perinteisesti PCR-pohjaisissa mutaatioanalyysimenetelmissä on käytetty geelielektroforeesia erottamaan mutaatiot villityypeistä. Denaturant gradient gel electrophoresis (DGGE) ja single strand conformation polymorphism (SSCP) ovat molemmat tällaisia laajasti käytössä olevia menetelmiä. DGGE:tä on pidetty vaivalloisempana mutta mutaatioita herkemmin tunnistavana menetelmänä kuin SSCP:tä, joka taas on yksinkertaisuutensa vuoksi käytetympi näistä kahdesta menetelmästä. Kapillaarielektroforeesitekniikan käyttöönoton mahdollistuminen SSCP:ssä on merkittävästi parantanut menetelmän herkkyyttä ja luotettavuutta mutaatioiden havaisemisessa.

Tässä työssä tutkittiin p53-geenin mutaatioita eksoneissa 5-9 keuhkosyöpänäytteistä ja verrattiin toisiinsa perinteistä DGGE:tä, kapillaarielektroforeesilla suoritettavaa SSCP:tä ja suoraa sekvensointia tarkoituksena selvittää automatisoidun kapillaarielektroforeesin edut ja herkkyys verrattuna muihin menetelmiin. Näytteitä oli 20, joista 17 sisälsi mutaation. Näistä DGGE:llä todettiin 15 (88 %), kapillaarielektroforeesi-SSCP:llä 16 (94 %) ja sekvensoinnilla 12 (71 %). Toinen DGGE:llä havaitsematta jääneistä mutaatioista sijaitsi intronissa eikä varsinaisesti tutkittavalla alueella. Kapillaarielektroforeesilla suoritettava SSCP ja DGGE vaikuttavat siis tämän tutkimuksen perusteella olevan yhtä herkkiä menetelmiä, tosin SSCP:n herkkyyttä voitaisiin todennäköisesti edelleen parantaa käyttämällä eri analyysilämpötiloja. Suoran sekvensoinnin herkkyys jäi selvästi heikommaksi kuin kummankaan seulontamenetelmän mutta se on kuitenkin ainoa menetelmä, joka kertoo myös mutaatioiden paikan ja emäsmuutoksen.

Kapillaarielektroforeesilla suoritettavan SSCP:n etuja DGGE:hen verrattuna ovat menetelmän yksinkertaisuus, automatisoituvuus ja tulosten käsittelyn helppous. Kapillaarielektroforeesilla suoritettavassa SSCP:ssä voidaan myös ajo-olosuhteita muuttaa nopeasti tarpeen mukaan ja yksittäisen näytteen uusiminen on helppoa. Ajojen välinen vaihtelevuus on pieni, toisin kuin DGGE:ssä, jossa geelit valetaan joka ajoa varten erikseen. Tämän työn tuloksien perusteella kapillaarielekroforeesilla suoritettava SSCP soveltuu hyvin p53-mutaatioiden seulontaan.