Validation of an assay for protein quantification using tritium detection
No Thumbnail Available
URL
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Kemian tekniikan korkeakoulu |
Master's thesis
Authors
Date
2024-01-22
Department
Major/Subject
Biosystems and Biomaterials Engineering
Mcode
CHEM3028
Degree programme
Master’s Programme in Life Science Technologies
Language
en
Pages
85 + 3
Series
Abstract
Validation of a new analytical method is done to estimate its fit for purpose prior taking the method as part of routine analyses of the laboratory. In method validation series of predefined experiments are done to determine values for chosen validation characteristics. With statistical tests it is possible to identify the parts of the assay that affect to the reliability of the assay. Different regulatory bodies give varying recommendations for validation procedure and different definitions of terminology may lead to misinterpretations and wrong conclusions. The aim of this work was to improve and validate a novelty protein quantification method, that is based on detecting tritium labelled ligand, StrepTactin-XT from protein sample. StrepTactin-XT binds specifically to Twin-Strep-tag. In this assay the Twin-Strep-tag is coded into N-terminal of the protein of interest, silk protein CBM-AQ12-CBM. The aim was to validate the methods suitability for its intended purpose and to determine linearity of calibration curve, limit of detection (LOD), limit of quantification (LOQ), accuracy and precision. The validation procedure was planned following recommendations of accredited validation organizations, but also taking into account the limitations that were set by the properties of the assay. The linear range of the assay was analysed using Fisher variance ratio and it was set to cover 6-350 ng. LOD and LOQ were determined using signal-to-noise relationship, and they were set to 6 ng and 13 ng, respectively. Relative error had variance between 0,3-70 %, making the average accuracy to be 78 %. For precision, the repeatability was on average 95 %, but due to limited time there was no possibility to measure intermediate precision.Analyyttisen menetelmän validoinnin tavoite on varmistaa sen soveltuvuus suunniteltuun tarkoitukseensa ennen menetelmän ottamista osaksi laboratorion rutiinianalyysejä. Validointiprosessissa suoritetaan sarja ennalta määritettyjä testejä, joissa määritetään arvot valituille validointiparametreille. Menetelmän eri vaiheiden luotettavuus on mahdollista todeta tilastollisia testejä hyödyntäen. Eri organisaatiot antavat toisistaan poikkeavia suosituksia validoinnin suorittamiseksi ja vaihtelevasti käytetty terminologia saattaa johtaa väärintulkintaan ja virheellisiin johtopäätöksiin. Tämän diplomityön tarkoitus oli optimoida ja validoida uusi proteiininmääritysmenetelmä, joka perustuu tritiumilla leimatun ligandin, StrepTactin-XT:n havaitsemiseen proteiininäytteessä. StrepTactin-XT sitoutuu spesifisti Twin-Strep-tagiin. Validoitavassa menetelmässä se on koodattu tutkittavan silkkiproteiinin, CBM-AQ12-CBM, N-terminaaliin. Työn päämääränä oli arvioida menetelmän soveltuvuutta sille suunniteltuun tarkoitukseen ja määrittää menetelmän lineaarinen alue, havaitsemis- ja määritysrajat, sekä mittaustarkkuus ja täsmällisyys. Validointiprosessi suunniteltiin ottaen huomioon akkreditoitujen validointiorganisaatioiden suositukset, mutta myös validoitavan metodin asettamat rajoitukset ja ominaisuudet. Menetelmän lineaarinen alue määritettiin käyttämällä Fisherin testiä ja sen arvioitiin kattavan konsentraatioalueen 6–350 ng välillä. Havaitsemis- ja määritysrajat arvioitiin signaalin ja kohinan suhteella ja niiden arvoiksi saatiin 6 ng ja 13 ng. Mitattujen näytteiden suhteellinen poikkeama vaihteli välillä 0,3–70 %, keskimääräinen mittatarkkuus oli 78 %. Lyhyen aikavälin täsmällisyyttä mittaava toistettavuus oli keskimäärin 95 %, pitkän aikavälin uusittavuutta ei voitu mitata diplomityön lyhyen keston asettamissa puitteissa.Description
Supervisor
Linder, MarkusThesis advisor
Malkamäki, MaariaGandier, Julie-Anne
Keywords
twin-strep-tag, method validation, liquid scintillation counting, silk protein