Potassium channel expression in cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem (iPS) cells

No Thumbnail Available

URL

Journal Title

Journal ISSN

Volume Title

School of Chemical Engineering | Master's thesis
Checking the digitized thesis and permission for publishing
Instructions for the author

Authors

Date

2012

Department

Biotekniikan ja kemian tekniikan laitos

Major/Subject

Polymeeriteknologia

Mcode

Kem-100

Degree programme

Language

en

Pages

viii + 59

Series

Abstract

Long QT syndrome (LQTS) is a heritable heart disease caused by different mutations in cardiac ion channels. The clinical manifestations include syncope, ventricular tachycardia and even sudden cardiac death and the disease is associated with prolongation of the QT interval on an electrocardiogram. Considerable variations in the phenotypic expression are present within families carrying the same mutation, the phenotype ranging from an asymptomatic carrier to those who have experienced severe arrhythmias. Induced pluripotent stem cell (iPSC) technology can be used to derive patient-specific cardiomyocytes and study the disease mechanisms in vitro. The patient-specific and control iPSC lines were maintained in an undifferentiated state by culturing them on MEF cells and differentiated into cardiomyocytes in a co-culture with END-2 cells. The mutation genotype was confirmed from the iPS cells by RFLP analysis and allelic discrimination qPCR. The extent of cardiac differentiation was evaluated by studying the mRNA expression levels of typical genes for undifferentiated and differentiated iPSCs. The potassium channel localization was studied by immunocytochemical stainings with LQTS associated potassium channel antibodies together with cardiac markers. This study showed that allelic discrimination qPCR can be used in the Heart Group of the Institute of Biomedical Technology (IBT) to genotype the iPS cell lines for three long QT syndrome causing mutations KCNQI-FinA, KCNQl FinB and HERG-FinA and can replace the traditional RFLP method. The validation of the HERG-FinB gene expression assay was technically failed. The cells in different phases of cardiac differentiation expressed typical genes regarding their differentiation phase. The differentiated cardiomyocytes were spontaneously beating and expressed cardiac marker proteins of functional cardiomyocytes. The HERG antibody used in this study was not found specific enough to study the channel localization. In the KCNQl staining no difference could be observed between the patient-specific cells and the cells from a control subject.

Pitkä QT oireyhtymä (LQTS) on periytyvä sydänsairaus, joka aiheutuu mutaatioista sydänsolujen ionikanavia koodaavissa geeneissä. Sairauden oireita ovat mm. tajunnanmenetyskohtaukset, eteisperäiset kammiovärinät ja jopa äkkikuolema. Pitkä QT oireyhtymälle on tyypillistä elektrokardiogrammissa näkyvä pidentynyt QT aika. Taudin fenotyypissä esiintyy merkittäviä vaihteluita jopa samaa mutaatiota kantavien perheenjäsenten välillä, fenotyypin vaihdellessa täysin oireettomasta kantajasta, vaikeita rytmihäiriöitä kokeneisiin potilaisiin. U udelleen ohjelmoiduista erittäin monikykyisistä kantasoluista (iPSC) erilaistetuilla sydänlihassoluilla voidaan tutkia taudin mekanismeja in vitro. Potilaista ja kontrollihenkiloista eristettyjä iPS kantasolulinjoja ylläpidettiin viljelemällä niitä MEF-solujen päällä ja ne saatiin erilaistumaan sydänlihassoluiksi kasvattamalla niitä END-2-solujen kanssa yhteisviljelmässä. Kantasolujen mutaation genotyyppi varmistettiin RFLP-analyysilla ja alleelidiskriminaatio-qPCR:llä. Kantasolujen erilaistumista sydänlihassoluiksi arvioitiin tutkimalla sekä erilaistumattomille kantasoluille, että erilaistuneille sydänsoluille tyypillisten geenien ilmentymistä mRNA-tasolla. Kaliumkanavien lokalisaatiota tutkittiin immunosytokemiallisesti värjäämällä solut LQTS:ään liittyvien kahden kaliumkanavan (KCNQ1 ja HERG) sekä sydänmarkkereiden vasta-aineilla. Tämän tutkimuksen perusteella alleelidiskriminaatio-qPCR:ää voidaan jatkossa käyttää Biolääketieteellisen teknologian yksikön (lBT) Sydänryhmän laboratoriossa iPS-linjojen genotyyppaukseen kolmen LQTS:ää aiheuttavan mutaation (KCNQ1-FinA, KCNQ1-FinB ja HERG-FinA) osalta ja se voi korvata aiemmin käytetyn RFLP-analyysimenetelmän. HERG-FinB-mutaation osalta validointi oli teknisesti epäonnistunut. Eri erilaistumisvaiheessa olevat sydänlihassolut ilmensivät niille tyypillisiä geenejä. Erilaistuneet sydänlihassolut sykkivät spontaanisti ja ilmensivät toiminnallisille sydänlihassoluille tyypillisiä sydänmarkkeriproteiineja. Tässä tutkimuksessa käytetyn HERG-kanavan vasta-aineen todettiin olevan liian epäspesifinen ko. kanavan lokalisaation tutkimiseen. KCNQ1-kanavan värjäyksien perusteella ei voita todeta eroa potilasspesifisten ja kontrollisolujen välillä.

Description

Supervisor

Seppälä, Jukka

Thesis advisor

Pekkanen-Mattila, Mari

Keywords

iPS cells, iPS solut, LQTS, sydänerilaistus, cardiac differentiation, alleelidiskriminaatio, allelic discrimination

Other note

Citation

Permanent link to this item

https://urn.fi/URN:NBN:fi:aalto-2020122859148

Collections

[dipl] Kemian tekniikan korkeakoulu / CHEM