Process development for Loosenin-like protein production and purification by Pichia pastoris, cultured in laboratory-scale bioreactor
Loading...
URL
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Kemian tekniikan korkeakoulu |
Master's thesis
Unless otherwise stated, all rights belong to the author. You may download, display and print this publication for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Authors
Date
2023-03-21
Department
Major/Subject
Biotechnology
Mcode
CHEM3022
Degree programme
Master's Programme in Chemical, Biochemical and Materials Engineering
Language
en
Pages
45+7
Series
Abstract
Lignocellulosic raw materials have shown great potential to replace fossil feedstocks in the pursuit of a greener economy. However, the enzymatic depolymerization of this complex material requires a wide variety of pro-teins. Loosenin-like proteins are a family of non-enzymatic proteins which are believed to loosen the junctions between cellulose fibres and thus facilitate enzymatic access. High cell density fermentations using Pichia pastoris (Komagataella phaffi) can be used for the production of recombinant proteins at bioreactor scale. Here, this strategy was used to, for the first time, scale up the production of PcaLOOL12 and PcaLOOL9 encoded by Phanerochaete carnosa using the P. pastoris strain SMD1168H. With a total of 6 productions, various parameters were experimented with, most notably different downstream processing systems, bioreactors, and pH values. The highest final protein yield that was achieved was 403.40 ± 10.65 mg L-1 using the PcaLOOL12- producing strain, a centrifugation based harvesting system, a pH of 6.0 and a 5L glass bioreactor. The highest cell density, 66.6 g of cell dry weight L-1, was achieved in a 7L metal bioreactor with the PcaLOOL9-producing strain with higher gas flow capabilities. However, the microfiltration and concentration- based downstream processing used for this run failed to give representative final yields due to various technical difficulties. Due to the limited number of runs and challenges with keeping key variables constant across the runs, this thesis did not seek to optimize recombinant protein production. Instead, this work suggests many guiding insights into how yields can be maximized further as well as some intuition regarding how to control the fermentation itself.Lignoselluloosaraaka-aineet tarjoavat paljon mahdollisuuksia fossiilisten materiaalien korvaamiseen siirtyessämme kohti vihreämpää taloutta. Tämän rakenteeltaan monimutkaisen materiaalin entsymaattinen depolymerointi on kuitenkin hankalaa ja vaatii useampia eri proteiineja. Loosenin-like proteiinit ovat ryhmä proteiineja, jotka eivät ole entsymaattisesti aktiivisia, mutta uskotaan pystyvän löysentämään selluloosakuitujen seassa olevia risteyskohtia, helpottaen entsyymien pääsyä kuitujen sekaan. Pichia pastoriskannan avulla tehtävää korkean solutiheyden fermentointia voi käyttää rekombinanttisten proteiinien tuotantoon bioreaktorimittakaavassa. Tässä opinnäytetyössä tätä strategiaa sovellettiin ensimmäistä kertaa Phanerochaete carnosan koodaamien proteiinien PcaLOOL12 ja PcaLOOL9 tuotannon skaalaamiseen käyttäen P. pastoris kantaa SMD1168H. Työn aikana tehtiin yhteensä 6 tuotantokertaa kokeillen erilaisia parametreja, erityisesti jälkikäsittelyjärjestelmiä, bioreaktoreita ja pH-arvoja. Suurin saavutettu lopputuotos oli 403,40 ± 10,65 mg L-1 käyttäen PcaLOOL12-tuottavaa kantaa, sentrifugaatioperusteista jälkikäsittelyä, 6.0:n pH:ta ja 5 L lasifermentoria. Suurin solutiheys, 66,6 g kuivapainosoluja L-1, saavutettiin PcaLOOL9-tuottavalla kannalla 7L metallisessa bioreaktorissa, joka mahdollisti myös korkeamman kaasuvirran. Valitettavasti tällä tuotantokerralla käytetty mikrosuodatus- ja konsentrointiperusteinen jälkikäsittely ei antanut edustavia lopputuottoja eräiden teknisten haasteiden takia. Rajoitettujen tuotantokertojen sekä keskeisten muuttujien pysyvinä pitämisen haasteiden vuoksi tämä opinnäytetyö ei pyrkinyt optimoimaan proteiinin tuotantoa. Sen sijaan tämä työ tarjoaa näkemyksiä siitä, miten tuottoja voitaisiin maksimoida tulevaisuudessa sekä intuitiivisia näkemyksiä fermentointien ohjaamisesta.Description
Supervisor
Master, EmmaThesis advisor
Dahiya, DeepikaKeywords
Loosenin-like, bioreactor, Pichia pastoris, LOOL9, LOOL12