Coupling of streptavidin to polymer nanoparticles

Abstract

Diagnostiikan sovelluksissa hyödynnetään lukuisia erilaisia nanokokoluokan partikkeleja, joiden pintaan on kytketty biomolekyylejä. Biomolekyylien kytkentään voidaan käyttää useita eri menetelmiä, joista yksi on nk. streptavidiini-biotiinitekniikka, joka perustuu streptavidiini- ja biotiini-molekyylien väliseen vahvaan vuorovaikutukseen. Tämän työn tavoitteena oli sitoa streptavidiinia kovalenttisesti europiumleimattuihin kopolymeeripartikkeleihin tunnettua happo-emäskytkentää käyttäen. Tämä mahdollistaisi erilaisten biomolekyylien sitomisen partikkeleihin biotiinin avulla, jolloin streptavidiinipintaisia partikkeleita voitaisiin käyttää useissa eri sovelluksissa vain vaihtamalla biotiinin avulla liitettävää biomolekyyliä. Työn toisena tavoitteena oli liittää biotiiniä vasta-aineisiin, eli biotinyloida vasta-aineita, sekä tutkia saadaanko biotinyloidut vasta-aineet kiinnitettyä streptavidiinipintaisiin partikkeleihin ja muodostettua antigeeneihin sitoutuvia konjugaattipartikkeleja.

Työn kirjallisuusosassa esitellään immunologian perusteita sekä tutustutaan X-avidiini-biotiinitekniikan (X-ABt) käyttöön biomolekyylien kytkennässä. Tarkemmin paneudutaan diagnostiikassa käytettäviin nanopartikkeleihin sekä näiden funktionalisointiin ja sovelluksiin. Todettiin, että partikkeleiden funktionalisointi biomolekyyleillä on tärkeä osa partikkelien valmistusprosessia ja että X-ABt sopii ensisijaisesti vähän partikkeleita kuluttaviin sovelluksiin johtuen tarvittavien reagenssien korkeasta hinnasta.

Kokeellisessa osuudessa streptavidiinille optimaalista happo-emäskytkentää haettiin vaihtelemalla kytkennässä käytettävän surfaktantin, Rhodafac RE-610, pitoisuutta välillä 0-0,06 %. Vasta-aineita biotinyloitiin kahdella eri menetelmällä. Streptavidiinin kytkeytymistä tutkittiin partikkelikokoanalysaattorilla sekä lateral flow -testien ja aikaviiveisen fluoresenssin avulla. Biotinyloinnin onnistumista tutkittiin samoilla menetelmillä, mutta myös turbiodometrisellä analysaattorilla Muodostettujen konjugaattipartikkelien toiminnallisuutta testattiin aikaviiveisen fluoresenssin avulla Streptavidiinin kytkennässä, biotinylornnissa sekä tavoitteiden mukaisen konjugaattipartikkelin muodostamisessa onnistuttiin Todettiin kuitenkin, ettei happo-emäskytkentä ole optimaalisin menetelmä streptavidiinin kytkemiseksi, sula Rhodafac RE-610 n havaittiin häiritsevän streptavidiinin kytkeytymistä partikkeleihin Todettiin myös ettei runsas streptavidiinimäärä partikkelin pinnalla takaa toimivimman konjugaattipartikkelin muodostumista Mikäli happoemäskytkentää halutaan jatkossa hyödyntää streptavidiinin sitomiseen, antoi tämä työ selkeät Suuntaviivat jatkotutkimuksiin sekä osoitti työtä käsittelevän kentän haasteet. Työssä onnistuttiin myös kartoittamaan käytetyille partikkeleille soveltuvia tutkimusmenetelmiä