Characterization of signaling protein mutants in Trichoderma reesei

Abstract

The filamentous fungus Trichoderma reesei is globally the most utilized producer of lignocellulolytic enzymes that degrade cellulose and hemicellulose, the most abundant organic polymers on Earth. The demand for these valuable lignocellulolytic enzymes is increasing rapidly as they are needed in the manufacturing of biobased products like bioethanol and textiles derived from biopolymers. The cellulase expression of T. reesei is a complex regulatory network dependent on the intracellular signal transduction that relays the information of the extracellular stimulus to the nucleus. In the nucleus, transcriptional regulation processes leading to protein synthesis are initiated as a response to the extracellular stimulus. However, not much is known about how T. reesei conveys these signals, and how do the signaling pathways affect the cellulase expression.

In fungi, most of the extracellular stimuli are sensed through G-protein coupled receptors (GPCR). The signals are relayed downstream to the nucleus via different signaling pathways. The central mechanisms in intracellular signaling are activation and deactivation of messenger proteins through phosphorylation by protein kinases and dephosphorylation by protein phosphatases.

The aim of this study was to characterize previously unknown deletion mutant strains of GPCRs, protein kinases, and protein phosphatases and evaluate their significance for the growth, protein production, and cellulase expression of T. reesei through different assays and experiments. A total of 39 deletion mutant strains were studied and additional eight production strains were constructed. The production strains contained some of the same genes studied in the deletion mutant strains, and the purpose of this was to study these genes further in a more modern industrial production strain background. The strains were assayed for enzymatic activity, total protein production, different inhibitors, and grown on different carbon sources.

Several of the previously unstudied genes proved to be important for the protein production, cellulase expression, inhibitor resistance, and growth of T. reesei, although in a yet elusive way. Further strain construction and experiments are required to unveil the mechanisms of how these genes affect the cellulase expression, protein production, and growth of T. reesei.

Rihmamainen sieni Trichoderma reesei on globaalisti tärkein lignosellulolyyttisten entsyymien tuotantoon käytetty organismi. Lignoselluloosa koostuu suurimmaksi osaksi selluloosasta ja hemiselluloosasta, jotka ovat planeetan yleisimmät orgaaniset polymeerit. Lignosellulolyyttisten entsyymien kysyntä kasvaa nopeasti, yhä useamman kuluttajan suosiessa ympäristöystävällisiä vaihtoehtoja omissa kulutustottumuksissaan. Lignosellulolyyttisiä entsyymejä tarvitaan esimerkiksi bioetanolin ja biopohjaisten tekstiilien valmistukseen. Lignosellulolyyttisten entsyymien tuotanto on riippuvaista solun sisäisistä signalointireiteistä, jotka välittävät tietoa solun ulkoisista ärsykkeistä tumaan. Tumassa signaali käynnistää vasteen ulkoiselle ärsykkeelle, yleensä muutokseen transkriptionaalisessa regulaatiossa johtaen tiettyjen proteiinien proteiinisynteesiin. T. reesei-homeen solun sisäisestä viestinnästä ei kuitenkaan tiedetä paljoa, eikä siitä mikä on eri signalointireittien rooli sellulaasien tuotannossa.

Sienet aistivat ympäristöään suureksi osaksi G-proteiinikytkentäisten reseptorien (GPCR) kautta. GPCR:t välittävät signaaleja solun pinnalta solun sisälle tumaan useita eri signalointireittejä pitkin. Solun sisäinen viestintä tapahtuu pääasiallisesti proteiinikinaasien suorittaman fosforylaation tai proteiniinfosfataasien suorittaman defosforylaation avulla.

Tämän työn tarkoituksena oli selvittää miten eri GPCR:t, proteiinikinaasit ja proteiinifosfataasit vaikuttavat T. reesei-homeen kasvuun, proteiinin tuotantoon, kemialliseen sensitiivisyyteen ja sellulaasien ekspressioon. Työssä karakterisoitiin 39 signalointimutanttikantaa, jonka lisäksi rakennettiin kahdeksan modernimpaa tuotantokantaa. Kokeissa mitattiin kantojen proteiinin tuotantoa, eri entsyymien aktiivisuuksia, kemiallista herkkyyttä eri inhibiittoreille ja kasvua eri hiilenlähteillä.

Usean tutkitun mutanttikannan havaittiin olevan oleellisia proteiineja homeen kasvulle, proteiinien ja sellulaasien tuotannolle, sekä kemialliselle sensitiivisyydelle. Lisätutkimuksia kuitenkin tarvitaan, jotta kyseisten geenien vaikutusmekanismit T. reesei-homeen metabolialle saataisiin selvitettyä.