Engineering of protein N-glycosylation in yeast – towards production of therapeutic antibodies

Thumbnail Image

URL

Journal Title

Journal ISSN

Volume Title

Kemian tekniikan korkeakoulu | Master's thesis

Authors

Date

2014-05-06

Department

Major/Subject

Biotekniikka ja elintarviketekniikka

Mcode

KE3002

Degree programme

KEM - Kemian tekniikan koulutusohjelma

Language

en

Pages

82+8

Series

Abstract

Antibodies and numerous other biopharmaceuticals contain N-glycans and other posttranslational modifications that affect their therapeutic efficacy. The early steps of the N-glycan assembly on the endoplasmic reticulum are conserved among eukaryotes but the glycan modifications in the Golgi apparatus are species-specific, resulting in different N-glycan structures in humans and yeasts. Glycoengineering provides a possibility to produce human-type glycans in yeast, making yeast an alternative host organism for the production of therapeutic glycoproteins. The objective of this thesis was to improve the production of a complex-type N-glycan in glycoengineered Saccharomyces cerevisiae by increasing the availability of UDP-N-acetylglucosamine and reducing interfering mannosyltransferase activity in the Golgi apparatus. The effects of expressing a UDP-N-acetylglucosamine transporter from Kluyveromyces lactis and the MNN1 and MNN2 gene deletions on N-glycosylation were tested in a ∆alg3 ∆alg11 S. cerevisiae strain expressing fusion proteins consisting of the catalytic domains of human N-acetylglucosamine transferases I and II and yeast Golgi apparatus targeting sequences. The N-glycans were isolated and purified from the cell wall glycoproteins, labeled with 2-aminobenzamide and analyzed using MALDI-TOF. The deletion of MNN1 eliminated the formation of glycans containing more than four mannoses, suggesting that Mnn1p transfers a second additional mannose to the core pentasaccharide glycan in the Golgi apparatus. However, the MNN2 deletion did not affect the glycan profile. The expression of the UDP-N-acetylglucosamine transporter increased the production of the complex-type glycan, and when combined with the MNN1 gene deletion, a glycan pattern with increased homogeneity was obtained. Glycoengineered S. cerevisiae is a promising host for the production of antibodies and other therapeutic glycoproteins. Further targets in its glycoengineering include the elimination of glycan mannosylation in the Golgi apparatus by the identification and deletion of the interfering α-1,2 mannosyltransferase or by the expression of an α-1,2 mannosidase, and improving the efficiency of the N-acetylglucosamine transfer by optimizing the catalytic activity and localization of the N-acetylglucosamine transferase fusion proteins and/or by further increasing the availability of UDP- N-acetylglucosamine in the Golgi apparatus.

N-glykosylaatio on translaation jälkeinen muokkaus, joka vaikuttaa vasta-aineiden ja lukuisten muiden biologisten lääkkeiden tehoon ja ominaisuuksiin. N-glykaanin biosynteesin solulimakalvolla tapahtuvat alkuvaiheet ovat eukaryooteilla yhteisiä, mutta Golgin laitteessa tapahtuvat N-glykaanin muokkaukset ovat lajispesifisiä. Siksi hiivassa tuotettujen glykoproteiinien N-glykaanit eroavat ihmisproteiinien N-glykaaneista. Muokkaamalla hiivasolujen N-glykosylaatioreittiä on mahdollista tuottaa ihmisen N-glykaanien kaltaisia N-glykaaneja myös hiivassa ja siten käyttää hiivasoluja terapeuttisten glykoproteiinien tuotantoon. Tämän diplomityön tavoitteena oli tehostaa kompleksityypin glykaanin muodostumista Saccharomyces cerevisiae -hiivassa parantamalla UDP-N-asetyyliglukosamiinin saatavuutta ja vähentämällä kilpailevaa mannosyylitransferaasiaktiivisuutta Golgin laitteessa. MNN1 ja MNN2 -geenien deleetion ja Kluyveromyces lactis -hiivan UDP-N-asetyyliglukosamiinin kuljettajaproteiinin ekspression vaikutusta glykosylaatioon tutkittiin ∆alg3 ∆alg11 S. cerevisiae -kannassa, joka ekspressoi ihmisen N-asetyyliglukosamiinitransferaasi I ja II –fuusioproteiineja Golgin laitteessa. N-glykaanit eristettiin ja puhdistettiin soluseinän glykoproteiineista, leimattiin 2-aminobentsamidilla ja analysoitiin käyttäen MALDI-TOF -massaspektrometriaa. MNN1-geenin deleetio esti yli neljä mannoositähdettä sisältävien glykaanien muodostumisen, joten kyseinen proteiini lisää todennäköisesti toisen ylimääräisen mannoosin ydinpentasakkaridiin. MNN2-geenin deleetio ei muuttanut merkittävästi glykaanien esiintyvyyttä. UDP-N-asetyyliglukosamiinin kuljettajaproteiinin ekspressio kasvatti halutun glykaanin suhteellista osuutta, ja aiempaa homogeenisempi glykaanijakauma saavutettiin yhdistämällä tämä MNN1-geenin deleetion kanssa. S. cerevisiae on lupaava tuotanto-organismi vasta-aineiden ja muiden terapeuttis¬ten glykoproteiinien tuotannossa. Tärkeimpiä kehityskohteita ovat mannosylaation estäminen Golgin laitteessa joko tunnistamalla ja inaktivoimalla kilpaileva α-1,2-mannosyyli¬transferaasi tai ekspressoimalla α-1,2-mannosidaasia Golgin laitteessa, sekä N-asetyyliglukosamiinin lisäyksen tehostaminen joko optimoimalla fuusioproteiinien katalyyttista aktiivisuutta ja sijaintia tai nostamalla UDP-N-asetyyliglukosamiinin pitoisuutta Golgin laitteessa.

Description

Supervisor

Frey, Alexander

Thesis advisor

de Ruijter, Jorg

Keywords

N-glycosylation, Saccharomyces cerevisiae, glycoengineering, MNN1, MNN2, N-glykosylaatio, Saccharomyces cerevisiae, glykosylaation muokkaus, MNN1, MNN2

Other note

Citation

Permanent link to this item

https://urn.fi/URN:NBN:fi:aalto-201405221862

Collections

[dipl] Kemian tekniikan korkeakoulu / CHEM