Biosynthesis of tetrahydroisoquinolines and their intermediates with Bacillus subtilis
Loading...
URL
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Kemian tekniikan korkeakoulu |
Master's thesis
Unless otherwise stated, all rights belong to the author. You may download, display and print this publication for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Authors
Date
2022-12-13
Department
Major/Subject
Biotechnology
Mcode
CHEM3022
Degree programme
Master's Programme in Chemical, Biochemical and Materials Engineering
Language
en
Pages
196 + 2
Series
Abstract
The objective of this Master’s thesis was to produce tetrahydroisoquinolines and their derivatives from bulk and inexpensive starting materials by utilizing a chemoenzymatic route. The aim of the work was to design and produce individually inducible expression system for acetolactate synthase, ω-transaminase, (R)-salsolinol synthase, (S)-norcoclaurine synthase and phenylethanoyl-N-methyltransferase (PNMT) in Bacillus subtilis. In addition, the aim of this work was to model the tertiary structure of the enzymes and proteins used in the work using in-silico methods for future use. A purchase order was placed for the designed de-novo plasmid which the custom gene synthesis company failed to produce. However, a partially constructed plasmid was acquired which was able to replicate in the host and contained intact sequences for the expression of (S)-norcoclaurine synthase and PNMT under eukaryotic promoters. The enzyme production for these enzymes were analyzed with SDS-PAGE. The results indicated successful enzyme expression for (S)-norcoclaurine synthase under Cu2+ inducible eukaryotic promoter, but the expression of PNMT under eukaryotic Fe3+ promoter was inconclusive. The expression system was re-designed and purchased which yielded a generic cloning shuttle vector for Escherichia coli and B. subtilis, capable to integrate desired payload into B. subtilis’ alpha-amylase (AmyE) locus. Genes for expression operons, the first consisting of ω-transaminase and the second consisting (R)-salsolinol synthase and (S)-norcoclaurine synthase were purchased and eventually received and cloned successfully into the shuttle vector successfully after modification of the defective promoter driving the fluorescent protein reporter producing gene. Gene synthesis companies were not able to produce operon for acetolactate synthase. Also the expression of PNMT was omitted to keep the project in reference time. Electroporation and thus other planned expression experiments for these two plasmids in B. subtilis could not be performed due the availability problems of laboratory space. Realistic tertiary structure models of the enzymes and proteins used in the work were successfully created, which can be used in future work.Tämän diplomityön päämääränä oli tuottaa tetrahydroisokinoliineja ja niiden johdannaisia yleisistä ja edullisista lähtöaineista kemoentsymaattista reittiä hyödyntäen. Työn tavoitteena oli tuottaa asetolaktaattisyntaasia, ω-transaminaasia, (R)-salsolinolisyntaasia, (S)-norkoklauriinisyntaasia ja fenyylietanoyyli-N-metyylitransferaasia ekspressiosysteemillä, jossa työtä varten suunniteltu shuttle-ekspressiovektori Bacillus subtilikselle ja Escherichia colille elektroporatoitiin B. subtilis WB600 bakteerikantaan. Lisäksi työssä oli tavoitteena mallintaa in-silico menetelmiä käyttäen työssä käytettävien entsyymien ja proteiinien tertiääristä rakennetta. Suunniteltu plasmidi tilattiin ostotyönä, se kyettiin toimittamaan ainoastaan osittan. Osittaisessa plasmidissa oli operonit ainoastaan (S)-norkoklauriinisyntaasin ja PNMT:n ekspressoimiseksi. Täten kokeet entsyymiekspressiolle voitiin suorittaa ainoastaan edellä mainittujen entsyymien osalta. Entsyymituotantoa analysoitiin SDS-PAGE:lla. Tulokset indikoivat onnistunutta enstyymiekspressiota (S)-norkoklauriinisyntaasille Cu2+ promoottorin ajamana, PNMT:n ekspression onnistuminen Fe2+ promoottorin ajamana jäi tulosten perusteella epäselväksi. Ekspressiosysteemi suunniteltiin uudelleen B. subtilikselle ja E. colille geneerisestä kloonaussukkalavektorista ja kahdesta ekspressiokasetista joista ensimmäinen sisälsi geenit ω-transaminaasin ja toinen (R)-salsolinolisyntaasista ja (S)-norkoklauriinisyntaasin ekspressoimiseksi. Ekspressiovektoreiden avulla oli tarkoitus kyetä integroimaan halutut geenioperonit B. subtiliksen alfa-amylaasi (AmyE) -lokukseen. Suunnitellut plasmidit tilattiin ostotyönä. Ekspressiokasettien kloonaus uudelleensuunniteltuun kloonausvektoriin tehtiin onnistuneesti sen jälkeen, kun kloonaussukkalvektorin fluoresoivaa proteiina tuottavan operonin viallinen promoottori saatiin korjattua. Geenisynteesiyritykset eivät pystyneet tuottamaan operonia asetolaktaattisyntaasiin. PNMT:tä vastaava ekspressio-operoni jätettiin pois, ajankäyttösyistä. Ekspressiosysteemille suunniteltuja kokeita ei voitu suorittaa loppuun tilankäytöllisten ongelmien vuoksi. Työssä käytetyille entsyymeille luotiin realistiset tertiääriset rakennemallit, joita voidaan käyttää tulevaisuudessa.Description
Supervisor
Linder, MarkusThesis advisor
Viskari, HeliKeywords
salsolinol, norcoclaurine, 1MeTiQ, transaminase, acetolactate, subtilis