Production and characterization of spherical biological designer colloids

Abstract

Design of protein interactions provides a modern approach for novel material development. Modification of the protein sequence results in changes in the protein’s physical properties and its intra- and intermolecular interactions. Genetic engineering offers tools for altering the protein sequence for this purpose, enabling, for example, design of specific process of protein self-assembly. Some cereal seed storage proteins self-assemble into spherical structures called ER-derived protein bodies (PB), being a potential material for this kind of material development. Similar PBs can be induced by maize γ-zein derived ZERA-peptide and fungal hydrophobin HFBI. These proteins have been studied for various composite material applications and represent potential fusion protein partners for large-scale protein production. This work was conducted in order to increase the knowledge of the interactions involved in the PB assembly and to characterize PBs. Multiple gene construct of ZERA, HFBI and ZERA-HFBI were cloned as fusion with green and red fluorescent proteins. The interactions between ZERA and HFBI were studied by co-expressing these constructs in transiently transformed Nicotiana benthamiana tobacco plants and observing leaf samples by confocal microscopy. PBs were isolated by subcellular fractionation for characterization. Also, the expression levels of constructs were determined. The results support the hypothesis that ZERA and HFBI have different mechanism for PB formation. Co-expression experiments showed that interaction between ZERA and HFBI is weaker than interaction between ZERA and ZERA or HFBI and HFBI. The determination of expression levels supported hypothesis that PB formation depends on the protein accumulation level in the cell. The isolation procedure was shown to be suitable also for HFBI PBs. The electron microscopy of ZERA and HFBI PBs revealed a porous structure and confirmed the spherical form for PBs. Novel PB structures were observed including radially assembled PBs and Januslike PBs in which the proteins were present in two separate domains within the PB.

Proteiinien vuorovaikutusten suunnitelmallinen muokkaaminen geenitekniikan avulla on nykyaikainen lähestymistapa uusien materiaalien kehityksessä. Proteiinisekvenssin muokkaaminen vaikuttaa proteiinin fysikaalisiin ominaisuuksiin sekä molekyylin sisäisiin ja ulkoisiin vuorovaikutuksiin mahdollistaen ennalta suunnitellun itsejärjestäytyvän rakenteen luomisen. Eräiden viljojen jyvissä esiintyvät varastoproteiinit varastoituvat jyviin pyöreiksi proteiinijyväsiksi järjestäytyneinä. Esimerkiksi maissin varastoproteiinin zeinin johdannaisen ZERA:n sekä Trichoderma reesei –homeen tuottaman hydrophobin I (HFBI) –proteiinin on todettu itsejärjestvvän vastaaviksi proteiinijyväsiksi, mikä tarjoaa mielenkiintoisen lähtökohdan nykyaikaiselle materiaalikehitystyölle. Näitä proteiineja on tutkittu useita materiaalisovelluksia varten ja niitä voidaan hyödyntää fuusioproteiinien osana teollisessa proteiinituotannossa. Työssä selvittiin vuorovaikutuksia, jotka johtavat näiden proteiinien järjestäytymiseen pyöreiksi proteiinijyväsiksi sekä tuotettiin ja puhdistettiin proteiinijyväsiä. Työssä kloonattiin useita geenikonstrukteja, jotka sisälsivät ZERA:n, HFBI:n tai ZERA-HFBI:n fuusiona fluoresoivan proteiinin kanssa. ZERA:n ja HFBI:n välisiä vuorovaikutuksia tutkittiin tuottamalla yhtä tai useampia geenikonstrukteja samanaikaisesti Nicotiana benthamiana tupakkakasveissa sekä mikroskopoimalla kasvisoluja. Proteiinijyvästen ominaisuuksien tutkimiseksi niitä tuotettiin tupakkakasveissa ja eristettiin lehtisolukosta fraktioimalla. Lisäksi geenikonstruktien proteiinituottotasot määritettiin. Tulosten perusteella ZERA ja HFBI järjestäytyvät proteiinijyväsiksi eri mekanismein. Tuottokokeet osoittivat, että ZERA:n ja HFBI:n väliset vuorovaikutukset ovat heikompia kuin ZERA-ZERA vuorovaikutukset ja HFBI-HFBI vuorovaikutukset. Tuottotasokokeet tukevat havaintoja siitä, että ZERA- ja HFBI-proteiinijyvästen muodostuminen riippuu kyseisen proteiinin konsentraatiosta solussa. Lisäksi todettiin, että ZERA-proteiinijyvästen eristykseen käytetty menetelmä soveltuu myös HFBI-proteiinijyvästen eristämiseen. Elektronimikroskopialla todettiin, että ZERA ja HFBI proteiinijyväset ovat rakenteeltaan pallomaisia ja huokoisia. Lisäksi tuottokokeissa havaittiin uudenlaisia proteiinijyväsiä: säteittäin järjestäytyneitä proteiinijyväsiä sekä Janus-partikkelien kaltaisia polaarisia proteiinijyväsiä.