Comparison, validation, and automation of two multicopper oxidoreductase activity assays
No Thumbnail Available
URL
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
School of Chemical Engineering |
Master's thesis
Authors
Date
2024-12-04
Department
Major/Subject
Biotechnology
Mcode
Degree programme
Master's Programme in Chemical, Biochemical and Materials Engineering
Language
en
Pages
85
Series
Abstract
Errors in enzyme activity results can lead to significant costs. Thus, ensuring measurement reliability and suitability for specific purpose is important. Proper validation guarantees that assays yield consistent and repeatable results across various conditions and laboratories. This thesis focused on comparing, validating, and automating two multicopper oxidoreductase activity assays. The thesis was conducted in collaboration with Roal Ltd, a company that manufactures industrial enzymes. Two enzyme activity assays, which use ABTS and syringaldazine as substrates, were tested. For confidentiality reasons, activity assays are referred to by invented activity definitions LU1 and LU2. The pre-validation phase included tests for repeatability, limit of detection (LOD), limit of quantification (LOQ), linear range, specific activity, and the effects of different pH buffers on activity. Based on the results, LU1 was chosen for a full validation. The full validation of LU1 involved precision and accuracy tests, consisting of reproducibility tests, and measurements conducted in another laboratory to measure bias. Additionally, LU1 assay was automated on liquid handling robot. Two liquid handling robot options were evaluated, Tecan Fluent 780 and Thermo Fisher Scientific Gallery. Thermo Fisher Scientific Gallery was chosen for automation. The results showed that LU1 was accurate and reliable under different conditions. The difference in LU1 activity results between the manual and automated methods was around 15 % due to lack of the correct wavelength filter and temperature conditions in the Gallery analyser, requiring a correction factor for accurate comparisons between manual and automated methods. It was found that the differences in LU1 activity between the manual and automated methods were sample dependent. Therefore, further measurements are necessary to calculate a reliable correction factor. Although the correlation between the manual and automated methods needs further research, validation was successful for the manual method and the analysis was adopted for routine use.Virheet entsyymiaktiivisuuden määritystuloksissa voivat aiheuttaa huomattavia kustannuksia, ja siksi mittausten luotettavuuden varmistaminen on ratkaisevan tärkeää. Asianmukainen validointi takaa, että määritykset tuottavat johdonmukaisia ja toistettavia tuloksia eri olosuhteissa ja laboratorioissa. Tässä diplomityössä keskityttiin kahden monikupari oksidoreduktaasi aktiivisuusanalyysin vertailuun, validointiin ja automatisointiin. Diplomityö tehtiin yhteistyössä teollisia entsyymejä valmistavan yrityksen, Roal Oy:n, kanssa. Työssä testattiin kahta entsyymiaktiivisuusmääritystä, LU1 ja LU2, jotka käyttävät substraatteina ABTS:ää ja syringaldatsiinia. Luottamuksellisuussyistä analyyseihin viitataan keksityillä määritelmillä LU1 ja LU2. Esivalidointivaiheessa testattiin toistettavuus, havaitsemisraja (LOD), määritysraja (LOQ), lineaarinen mittausalue, spesifinen aktiivisuus ja eri pH-puskurien vaikutus aktiivisuuteen. Tulosten perusteella LU1 valittiin validoitavaksi kokonaan, johon sisältyi uusittavuus testeistä koostuvia tarkkuuskokeita ja toisessa laboratoriossa suoritettuja mittauksia luotettavuuden varmistamiseksi. Lisäksi LU1:n määritys automatisoitiin nesteenkäsittelyrobotille. Työssä arvioitiin kahta nestekäsittelyrobotti vaihtoehtoa, Tecan Fluent 780:aa ja Thermo Fisher Scientific Gallerya. LU1 automatisoitiin Gallery nesteenkäsittelyrobotille. Tulokset osoittivat, että LU1 oli tarkka ja luotettava eri olosuhteissa. Erot LU1-aktiivisuustuloksissa manuaalisen ja automatisoidun menetelmän välillä olivat noin 15 %, mikä johtui siitä, että Galleryssä ei ollut oikeita aallonpituus suodattimia ja lämpötilaolosuhteita, mikä edellytti korjauskertoimen laskemista tarkkojen vertailujen tekemiseksi. Havaittiin, että LU1-aktiivisuuksien erot manuaalisen ja automaattisen menetelmän välillä olivat näytteestä riippuvaisia, joten luotettavan korjauskertoimen laskemiseksi on tulevaisuudessa tehtävä lisämittauksia. Vaikka manuaalisen ja automatisoidun menetelmän välinen korrelaatio vaatii lisätutkimuksia, manuaalisen menetelmän validointi onnistui ja LU1-analyysi otettiin rutiinikäyttöön yrityksessä.Description
Supervisor
Scheller, SilvanThesis advisor
Rannaste, ErikKeywords
multicopper oxidoreductase, method validation, laboratory automation, linear regression, ANOVA, repeatibility, limit of detection, limit of quantification