Expression of new microbial expansin-like proteins and their characterization using binding studies
Loading...
URL
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Kemian tekniikan korkeakoulu |
Master's thesis
Unless otherwise stated, all rights belong to the author. You may download, display and print this publication for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Authors
Date
2023-08-22
Department
Major/Subject
Biotechnology
Mcode
CHEM3022
Degree programme
Master's Programme in Chemical, Biochemical and Materials Engineering
Language
en
Pages
64+8
Series
Abstract
Microbial expansins are proteins shown to facilitate the disruption of cellulose in a non-lytic manner, thus providing a possible means for the processing of plant and fungal biomass. To reveal the role and the function of these proteins in detail, characterization experiments such as binding and synergism assays are performed with different substrates. The proteins for these experiments are acquired with recombinant expression using suitable host organisms for large-scale productions, such as Komagataella phaffii. In this thesis, the expression of 7 novel microbial expansin-related proteins were up-scaled to pilot-scale bioreactors in total of 11 productions using K. phaffii strains SMD1168H (Mut+) and KM71H (MutS). The total volumes of the used bioreactors were 5, 7 or 200-liters. Parameters such as the induction temperature, pH and the carbon feeding were tested in an iterative manner. The productions were followed by a characterization work of 6 expansin-related proteins using binding assays. The experiments were performed at pH values 3.5, 5 and 7.5. The used commercial and industrial substrates originated from plant and fungal sources, including Avicel, softwood kraft pulp, Pleurotus ostreatus and chitin. The volumetric yields of the productions varied from 0 to 116,4 mg L−1 with the KM71H strain. The best yield (ScoEXLX6144 116,4 mg L−1, 2,8 mg g−1) was achieved with the following conditions: pH 5.5, induction temperature 20 ◦C accompanied by a prolonged glycerol fed-batch with 4,38% (wt/vol) glycerol and 0,5% (vol/vol) methanol feeding. The trend in the growth curves suggested an insufficient carbon availability during the induction phase when using the methanol-limited fed-batch technique. For PcaLOOL12, the expression was successfully up-scaled to the 200-liter bioreactor using previously determined parameters (pH 6, induction temperature 20 ◦C) with the SMD1168H strain. In the characterization work, the affinity towards the substrates decreased as the pH turned to more alkaline in general. Additionally, several microbial expansins exhibited unstable behavior at pH 3.5. For this reason, pH 5 was determined to be the optimum binding condition for these expansins. Few differences were observed in the binding patterns of the acidic (pI<6) and the basic expansins (pI>8) that were hypothesized to result from the dissimilarities in the electrostatic component facilitating the binding.Mikrobiperäisten expansin-kaltaisten proteiinien on näytetty hajottavan selluloosakuituja ei-lyyttisesti. Näin ollen, mikrobiperäiset expansin-proteiinit voisivat tarjota ratkaisun kasvi- ja sienimassan prosessoinnin haasteisiin. Expansin-kaltaisten proteiinien toimintaa ja alkuperäistä roolia isäntäsolussa tutkitaan karakterisointikokeiden avulla, joihin kuuluvat muun muassa sitoutumis- ja synergiakokeet. Karakterointia edeltää tutkittavien proteiinien ekspressio, joka tapahtuu sopivaa isäntäeliötä käyttämällä. Eukaryootteihin kuuluva hiiva Komagataella phaffii on suosittu isäntäeliö isomman mittakaavan rekombinattiproteiinien tuotantoon. Tässä diplomityössä seitsemän expansin-kaltaisen proteiinin ekspressio skaalattiin pilot-mittakaavaan käyttämällä 5-, 7- tai 200-litran bioreaktoreita. Yhdessätoista tuotannossa käytettiin K. phaffii kantoja SMD1168H (Mut+) ja KM71H (MutS). Tuottoon vaikuttavia parametreja (mm. pH, lämpötila induktion aikana, hiililähteen syöttö) iteroitiin tuotantojen välillä. Ekspressiotyötä seurasi kuuden expansin-kaltaisen proteiinin karakterisointi sitoutumiskokeiden avulla. Sitoutumiskokeet suoritettiin pH:issa 3.5, 5 ja 7.5 ja substraatteihin kuului kasviperäisiä (selluloosa, ksylaani, sulfaattiprosessoitua lehti- ja havupuuta) ja sieniperäisiä substraatteja (kitiini, esikäsitelty myseeli). Tuotantojen volumetriset tuotot vaihtelivat välillä 0-116,4 mg L−1 KM71H kantaa käytettäessä. Paras tuotto saavutettiin yhdistämällä parametrit pH 5.5 ja induktiolämpötila 20 ◦C-astetta pidennettyyn glyserolin syöttöön (4,38% g/L media) kasvuvaiheessa ja kohtalaisella metanolikonsentraatiolla (0,5% vol/vol) ekspressiovaiheessa. Tuotantojen kasvukäyrät viittasivat riittämättömään energiansaantiin ekspressiovaiheen aikana. PcaLOOL12 tuotto skaalattiin onnistuneesti 200-litran bioreaktoriin käyttämällä aikaisemmin optimoituja parametreja (pH 6, induktiolämpötila 20 ◦C-astetta). Sitoutumiskokeissa affiniteetti laski yleisesti pH:n noustessa. Tämän lisäksi useat proteiinit käyttäytyivät epästabiilisti pH:ssa 3.5 ja seuraavaksi suurin affiniteetti substraatteihin havaittiin pH:ssa 5. Sitoutumiskokeissa huomattiin joitain trendejä eri expansin-proteiinien välillä riippuen oliko proteiinin isoelektrinen piste alle 6 tai yli 8. Hypoteesin mukaan isoelektrinen piste voi vaikuttaa sitoutumisen sähköstaattiseen komponenttiin ja siten affiniteettiin.Description
Supervisor
Master, EmmaThesis advisor
Dahiya, DeepikaKeywords
microbial expansin-related proteins, Komagataella phaffii, protein expression, binding assay