Endo-galaktanaasin puhdistus ja karakterisointi

No Thumbnail Available

URL

Journal Title

Journal ISSN

Volume Title

Helsinki University of Technology | Diplomityö
Checking the digitized thesis and permission for publishing
Instructions for the author

Authors

Date

1997

Department

Kemian tekniikan osasto

Major/Subject

Biokemia

Mcode

Kem-30

Degree programme

Language

fi

Pages

viii + 79

Series

Abstract

Työn tutkimusosassa oli tavoitteena puhdistaa kromatografisin menetelmin kaupallisesta entsyymivalmisteesta endogalaktanaasi, joka hydrolysoi galaktaania. Puhdistettu entsyymi karakterisoitiin ja tutkittiin sen substraattispesifisyyttä ja kykyä hydrolysoida kuusen mekaanisen massan ja mäntysulfaattimassan galaktaanirakenteita. Kirjallisuusosassa tarkasteltiin galaktaania sisältäviä substraatteja, niitä hydrolysoivia entsyymejä sekä galaktanaasien tuottoa ja käyttösovelluksia. Esikokeiden perusteella valittiin puhdistuksen lähtöliuokseksi kahdesta kaupallisesta entsyymivalmisteesta Pectinex Ultra SP-L, joka sisälsi enemmän galaktanaasiaktiivisuutta. Puhdistuksen ensimmäinen vaihe oli anioninvaihtokromatografia (DEAE Sepharose FF), joka ajettiin suolagradientilla. Siinä erottuivat mannanaasi-, endoglukanaasi- ja ksylanaasiaktiivisuuksia sisältäneet proteiinit galaktanaasiaktiivisuutta sisältäneestä proteiinista. Puhdistuksen toinen vaihe oli kationinvaihtokromatografia (CM Sepharose FF), joka ajettiin pH-gradientilla. Osa proteiinista ei adsorboitunut geeliin ja se ajettiin uudestaan pH-gradientilla kationinvaihtokromatografiapylväässä alhaisemmassa pH:ssa. Viimeinen vaihe puhdistuksessa oli geelisuodatus (Sephacryl S100 HR). Galaktanaasi puhdistui 126-kertaisesti. Puhdistetun galaktanaasin spesifinen aktiivisuus oli 43000 nkat mg[-1] beta-1,4-galaktaanilla määritettynä ja se sisälsi 0,12 % alkuperäisen näytteen proteiinista. Puhdistetun endogalaktanaasin molekyylikoko oli 38 000 Da SDS-PAGE:lla määritettynä. Sama tulos saatiin myös geelisuodatuksesta. Entsyymin isoelektristä pistettä ei pystytty määrittämään. Galaktanaasin pH-optimi oli 4,5 lupiinin beta-1,4-galaktaanilla määritettynä. Se oli stabiili pH-välillä 4,2-7,0 lämpötilassa 40°C ja pH:ssa 4,5 lämpötilaan 40°C asti. Entsyymi hydrolysoi lupiinin beta-1,4-galaktaania ja mustalipeästä eristettyä galaktaania muodostaen galaktoosia ja erilaisia galakto-oligomeerejä. Se ei hydrolysoinut lehtikuusen beta-1,3-arabinogalaktaania, koivun ksylaania, beta-glukaania eikä lineaarista mannaania ja galaktomannaania. Tulosten perusteella Pectinex Ultra SP-L:sta puhdistettu entsyymi oli endo-beta- 1,4-galaktanaasi (EC 3.2.1.89). Galaktanaasi liuotti jonkin verran galaktoosipitoisia oligomeerejä kuusen mekaanisesta massasta ja hieman enemmän mäntysulfaattimassasta.

Description

Supervisor

Laakso, Simo

Thesis advisor

Luonteri, Elina
Siika-aho, Matti

Keywords

Other note

Citation

Permanent link to this item

https://urn.fi/URN:NBN:fi:aalto-2020120343897

Collections

[dipl] Teknillinen korkeakoulu / TKK