The regulation of small RNA genes in Escherichia coli

No Thumbnail Available

URL

Journal Title

Journal ISSN

Volume Title

Helsinki University of Technology | Diplomityö
Checking the digitized thesis and permission for publishing
Instructions for the author

Authors

Date

2009

Department

Kemian ja materiaalitieteiden tiedekunta

Major/Subject

Biokemia ja mikrobiologia

Mcode

Kem-30

Degree programme

Language

en

Pages

vii + 73 s. + liitt. 37

Series

Abstract

In the literature survey part, the available literature data about small RNA and the identified proteins were reviewed. The isolation method was also described and factors affecting the binding of proteins to the DNA affinity beads were discussed. Two Escherichia coli small RNA genes, sraH and sroJ, were chosen as the most likely candidates to be regulated by regulatory proteins based on previous research. Experimental methods were employed to isolate proteins binding specifically to the upstream DNA of the two small RNA genes. After the cells were harvested at the appropriate growth phase, the crude protein extract was incubated with DNA affinity beads and the isolated proteins identified with MALDI-TOF mass spectrometry. Further experiments were undertaken with knockout mutants whose small RNA levels were estimated with Northern blotting. Bioinformatical methods were used to locate possible regulatory protein binding sites in the sequences bound to the superparamagnetic beads. Pattern searches were conducted with the Patser program and alignments of gene sequences from related bacteria with ClustalW. The isolation process used turned out to be relatively robust despite the trial and error involved in determining the optimal conditions for the binding of the proteins to the DNA affinity beads. The proteins Ga1S, LrhA and NadR were isolated and identified as regulatory proteins binding to the sraH and YgbI and YfhH to the sraJ upstream sequence. Unfortunately, no conclusive proof that these proteins regulate the small RNA genes could be obtained by Northern blotting.

Työn kirjallisuusosassa on käyty läpi kirjallisuutta liittyen pieni-RNA-molekyyleihin ja tunnistettuihin proteiineihin. Lisäksi on esitelty eristysmenetelmää ja tekijöitä, jotka vaikuttavat proteiinien sitoutumiseen käytettyihin magneettikuuliin. Kaksi Escherichia coli pieni-RNA-geeniä, sraH ja sraJ, arvioitiin aikaisemman tutkimuksen perusteella olevan todennäköisesti säätelyproteiinien säätelemiä. Kokeellisien menetelmien avulla eristettiin proteiineja, jotka sitoutuivat näiden kahden geeniä edeltäviin DNA-jaksoihin. Solut kerättiin valitussa kasvuvaiheessa, hajotetut solut inkuboitiin magneettisten affiniteettikuulien kanssa ja eristetyt proteiinit tunnistettiin MALDI-TOF massaspektrometrian avulla. Lisäkokeita suoritettiin knockout-mutanteilla, joitten pieni-RNA-määriä arvioitiin Northern-blottausmenetelmällä. Bioinformaatiomenetelmillä pyrittiin mahdollisten säätelyproteiinien sitoutumiskohtien paikantamiseen magneettikuuliin liitetyistä DNA-jaksoista. Sitoutumiskohtajaksojen haut suoritettiin Patser-sovelluksella ja sukulaisbakteerien geenijaksojen rinnastukset ClustalW-sovelluksella. Eristysmenetelmä tuotti toistettavia tuloksia huolimatta todennäköisesti epäoptimaaleista olosuhteista kyseisten proteiinien sitoutumiselle DNA-kuuliin. GaIS-, LrhA- ja NadR-proteiinit eristettiin ja tunnistettiin sraH-geeniä edeltävään jaksoon sitoutuviksi ja YgbI- ja YfhH-proteiinit sraJ-geeniä edeltävään jaksoon sitoutuvaksi. Northern-blottausmenetelmällä ei pystytty kuitenkaan todistamaan, että löydetyt proteiinit säätelevät geenien ilmenemistä.

Description

Supervisor

Laakso, Simo

Thesis advisor

Bollinger, Christian

Keywords

Other note

Citation

Permanent link to this item

https://urn.fi/URN:NBN:fi:aalto-2020120555781

Collections

[dipl] Teknillinen korkeakoulu / TKK