Characterising the effect of green fluorescent protein fusion on recombinant spider silk fibres
No Thumbnail Available
URL
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Kemian tekniikan korkeakoulu |
Master's thesis
Authors
Date
2024-08-29
Department
Major/Subject
Biotechnology
Mcode
CHEM3022
Degree programme
Master's Programme in Chemical, Biochemical and Materials Engineering
Language
en
Pages
86
Series
Abstract
Renewable biomimetic and bio-based materials are gathering increased interest as sustainable replacements for fossil man-made materials. Spider silk is a natural protein-based fibre that outperforms synthetic fibres, making it attractive for many applications. Industrial production of spider silk requires the use of recombinant protein technology, and functionalizing recombinant silk relies on the design of artificial silk proteins that form fibres on par with native silk. This requires knowledge about mechanisms underlying fibre assembly and how sequence structure relates to assembly and performance. Fluorescent marker proteins are sometimes used in such efforts, but the spinnability and mechanical properties of fusions are seldom tested. Moreover, developing silk with unique properties, like built-in colour at the molecular level, without hampering performance, would further boost its value. Three previously developed recombinant spider silk constructs were fused with the commonly used marker protein enhanced green fluorescent protein (eGFP). The three eGFP silk constructs were produced alongside their corresponding non-eGFP constructs either in shake flasks or in a bioreactor to assess the possibility of scale- up. Constructs were biomimetically spun into fibres with a wet spinning approach that only uses aqueous solutions, and fibres were tensile tested to compare the mechanical properties and behaviour of eGFP silk to non-eGFP silk. Spinning parameters were toggled to assess how eGFP silk behaves in different conditions and to evaluate if its performance could be improved by minor protocol alterations. The specific impact of eGFP on fibre structure and performance was evaluated. The eGFP silk variants were spinnable just as their corresponding non-eGFP variants and spinning yielded visibly green eGFP fibres. Mechanical testing revealed that eGFP silk behaves differently than non-eGFP silk and has inferior mechanical properties. Tweaking spinning conditions resulted in stronger eGFP fibres, but they were still weaker than non-eGFP ones. Reasons for differences could be dissimilar parameters used in spinning, which makes results demanding to compare, but also divergence in secondary structure, unfavourable intermolecular interactions, and steric hindrance, resulting from eGFP fusion.Förnybara biobaserade material används för att ersätta fossila material som en del av hållbar utveckling. Spindelsilke är en naturlig proteinbaserad fiber med mekaniska egenskaper som överträffar syntetiska fibrer, något som möjliggör många användningsändamål. Industriell produktion av silke görs med rekombinant proteinteknologi och funktionalisering av materialet kräver utveckling av artificiella spindelslikesproteiner, som kan spinnas till lika bra fibrer som naturligt silke. Detta förutsätter kunskap om relationer mellan proteinsammansättning och fibrernas formation samt egenskaper, och om underliggande mekanismer. Fluorescerande markörproteiner används ibland i studier, men spinnabiliteten och egenskaperna av fusioner testas sällan. Molekylär färgning av fibrer kan även införa mervärde. En av de vanligaste proteinmarkörerna, grönt fluorescerande protein (eGFP), fusionerades med tre spindelsilkesproteiner. De tre eGFP silkesvarianterna producerades tillsammans med motsvarande icke-eGFP varianter i flaska samt i bioreaktor, för att bedöma om uppskalning av produktion är möjligt. Varianterna spanns till fibrer genom biomimetiskt spinnande, där endast vattenlösningar används. Fibrernas mekaniska egenskaper testades med dragprov och eGFP fibrernas egenskaper jämfördes med icke-eGFP fibrer. Genom ändring av spinningsparametrar forskades hur eGFP-fibrer beter sig i olika förhållanden och om det är möjligt att enkelt förbättra deras mekaniska egenskaper. Hur tillsatsen av eGFP specifikt påverkar fibrernas struktur och egenskaper diskuterades. Alla eGFP silkesvarianter kunde spinnas till fibrer helt som motsvarande icke-eGFP varianter och eGFP fibrerna hade en tydlig grön färg. Mekaniska proverna påvisade att eGFP fibrer har sämre mekaniska egenskaper och beter sig olika än icke-eGFP fibrer i liknande förhållanden. De mekaniska egenskaperna kunde förbättras genom att justera spinningsparametrar, men egenskaperna förblev sämre än för icke- eGFP fibrer. Sämre egenskaper för eGFP fibrer beror möjligtvis på användning av olika parametrar i spinnandet av eGFP och icke-eGFP varianter, vilket försvårar tolkning av resultaten. eGFP inför potentiellt även skillnader i sekundärstruktur, ogynnsam elektrostatisk växelverkan och steriska hinder.Description
Supervisor
Linder, MarkusThesis advisor
Sammalisto, Fred-EricKeywords
spider silk, eGFP, biomimetic materials, biomimetic spinning, mechanical properties, recombinant protein production