Comparative analysis of transaminases for their ability to aminate oxidized carbohydrates
Loading...
URL
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Kemian tekniikan korkeakoulu |
Master's thesis
Unless otherwise stated, all rights belong to the author. You may download, display and print this publication for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Authors
Date
2022-03-25
Department
Major/Subject
Biotechnology
Mcode
CHEM3022
Degree programme
Master's Programme in Chemical, Biochemical and Materials Engineering
Language
en
Pages
90 + 1
Series
Abstract
Carbohydrate-active enzymes are mostly utilized in a deconstructive manner, where long carbohydrate chains are decomposed into smaller and smaller units. Biocatalysis offers another route, where carbohydrate substrates are functionalized for added value. One way to achieve this is biocatalytic cascades combining enzymes to introduce desirable functionalities, such as amine groups. Aminated carbohydrates are interesting in several polymer applications, such as textiles, personal care products and chelating materials. Galactose oxidase from Fusarium graminaerum was used to oxidize the C6-position of galactose-containing carbohydrates. Activity data was then collected for 10 different (S)- or (R)-selective transaminases using galactose, lactose, and melibiose as substrates. None of the (R)-selective transaminases or the (S)-selective variants of 3FCR structure showed activity on any of the tested oxidized substrates. Based on activity data, 4 (S)-selective transaminases were selected for further characterization, 3 of them being variant forms of the same structure (PDB: 3HMU), and the fourth a transaminase from Chromobacterium violaceum. Selected transaminases were employed in oxidation-transamination cascades with FgrGaOx, where yields of aminated products were compared in both simultaneous and sequential setups. Results clearly indicated that simultaneous addition of both enzymes vastly increased the yield of aminated carbohydrates. Based on activity data and reaction cascade yields, mutation W63Y in 3HMU was shown to be detrimental to transaminase activity towards galactose-containing substrates, indicating that the tryptophan residue is important for this application. This tryptophan residue was conserved between all three enzymes exhibiting the highest activities.Hiilihydraattiaktiivisia entsyymeitä käytetään pitkälti dekonstruktiivisesti, jolloin pitkiä hiilihydraattiketjuja pilkotaan yhä pienemmiksi hiilihydraateiksi. Biokatalyysi tarjoaa myös toisen tavan lähestyä hiilihydraatteja raaka-aineina, jossa substraattien funktionalisointi luo lisäarvoa. Yksi tapa tähän on kaskadireaktiot, joissa useiden entsyymien avulla hiilihydraatteihin saadaan haluttuja funktionaalisuuksia, kuten aminoryhmiä. Aminoidut hiilihydraatit puolestaan ovat mielenkiintoisia monissa polymeerisovelluksissa, kuten tekstiileissä, terveys- ja hygieniatuotteissa ja kelatoivissa aineissa. Galaktoosia sisältävien hiilihydraattien – galaktoosin, laktoosin ja melibioosin C6-hiili hapetettiin galaktoosioksidaasilla Fusarium graminaerumista. Kymmenen erilaisen (S)- ja (R)-selektiivisen transaminaasin spesifinen aktiivisuus mitattiin C6-hapetettuja hiilihydraatteja kohti. Yksikään (R)-selektiivinen ensyymi eikä rakenteen 3FCR variantti ei osoittanut aktiivisuutta. Aktiivisuusdatan perusteella neljää (S)-selektiivistä transaminaasia karakterisoitiin lisää. Kolme näistä oli variantteja PDB-rakenteesta 3HMU, ja yksi oli transaminaasi Chromobacterium violaceum bakteerista. Valittuja transaminaaseja tutkittiin yhdessä galatoosioksidaasin kanssa hapetus-aminointikaskaadeissa, ja aminoitujen tuotteiden saantoja vertailtiin peräkkäisissä ja yhdenaikaisissa ”one-pot” kaskadireaktioissa. Tuloksien perusteella yhdenaikainen entsyymien lisäys lisäsi aminoitujen tuotteiden saantoa huomattavasti. Aktiivisuusdatan ja laskettujen saantojen perusteella mutaatio W63Y rakenteessa 3HMU haittaa galaktoosia sisältävien hiilihydraattien aminointia, osoittaen tryptofaanin tässä positiossa olevan tärkeä aminohappo tälle sovellukselle. Kaikkien aktiivisimpien entsyymien aktiivisesta kohdasta löytyy tryptofaani tästä positiosta.Description
Supervisor
Master, EmmaThesis advisor
Momeni, MajidKeywords
transaminase, galactose oxidase, reaction cascade, carbohydrate, biocatalysis