High throughput fermentation and metabolite analysis of genetically engineered yeasts

Thumbnail Image

URL

Journal Title

Journal ISSN

Volume Title

Kemian tekniikan korkeakoulu | Master's thesis

Authors

Date

2020-08-17

Department

Major/Subject

Biosystems and Biomaterials Engineering

Mcode

CHEM3028

Degree programme

Master’s Programme in Life Science Technologies

Language

en

Pages

162 + 41

Series

Abstract

Production of chemicals with living cells, e.g., microbes, through their biochemical metabolic pathways, has become one of the most important manufacturing technologies. Engineering cellular metabolism takes, however, a long time before reaching an industrial production level. The metabolic network is a highly complex system that is regulated through multiple pathways and mechanisms. A design-build-test-learn (DBTL) cycle has been successfully applied as a systematic tool for metabolic engineering. Acceleration of the cycle enables faster production host development, achieved by utilizing computational tools, robotics, and automation. In this thesis, high throughput fermentation and sample analytics system was implemented together to facilitate the faster screening of metabolically engineered yeast strains for bioprocess development. For this purpose, high-performance ion chromatography, Thermo Scientific™ Dionex™ ICS-6000 HPIC, and ultra-high-performance liquid chromatography, Waters Acquity UPLC®, were utilized for the analysis of extracellular and intracellular metabolites. They were linked to an automated fermentation system, Sartorius Ambr® 250, and an automated liquid handling platform, Tecan Fluent® 780. The research utilized yeast strain Pichia kudriavzevii that has been genetically engineered to produce glycolic acid. Automatic fermentation was only discussed in theory, as problems were encountered in analytics. The primary analytical instrument, Dionex™ ICS-6000 HPIC, malfunctioned during the installation. Thus, the focus was re-allocated to Acquity UPLC®. However, a broad peak was continuously observed with the photodiode array (PDA) detector covering a large part of the chromatogram. The peak was caused by aqueous pulse due to the gradient. Thus, the results were obtained only with a mass detector (MS). The analyses ultimately yielded promising results in determining several different metabolites. Also, the metabolite extraction was found to be successful with Fluent® 780

Kemikaalituotannosta elävien solujen, kuten mikrobien, avulla biokemiallisten metabolisten reittien kautta on tullut yksi tärkeimmistä valmistustekniikoista. Solujen aineenvaihdunnan kehittäminen vie kuitenkin kauan ennen teollisen tuotantotason saavuttamista. Metabolinen verkko on erittäin monimutkainen järjestelmä, jota säädellään useilla reiteillä ja mekanismeilla. Suunnittele-rakennatestaa-opi-sykliä (engl. design-build-test-learn, DBTL) on onnistuneesti sovellettu systeemisenä työkaluna aineenvaihdunnan muokkaamiseen. Sykliä nopeuttamalla mahdollistetaan nopeampi tuotantoisäntien kehitys, joka saavutetaan laskennallisilla työkaluilla, robotiikalla ja automaatiolla. Tässä diplomityössä yhdistettiin korkean suorituskyvyn (engl. high throughput) fermentaatio ja näyteanalyysisysteemi bioprosessien kehitystä varten nopeuttamaan metabolisesti muokattujen hiivakantojen seulontaa. Tähän tarkoitukseen otettiin käyttöön korkean erotuskyvyn ionikromatografi, Thermo Scientific™ Dionex™ ICS-6000 HPIC, ja erittäin korkean erotuskyvyn nestekromatografi, Waters Acquity UPLC®, solunulkoisten ja solunsisäisten metaboliittien analysointiin. Ne yhdistettiin automatisoituun fermentointijärjestelmään, Sartorius Ambr® 250:een, ja automatisoituun nesteenkäsittelyalustaan, Tecan Fluent® 780:een. Tutkimuksessa hyödynnettiin Pichia kudriavzevii -hiivakantaa, joka on geneettisesti muunneltu tuottamaan glykolihappoa. Automaattisesta fermentoinnista puhuttiin vain teoriatasolla, sillä analytiikassa ilmeni ongelmia. Ensisijainen analyyttinen instrumentti, Dionex™ ICS-6000 HPIC, hajosi asennuksessa. Siksi työssä keskityttiin Acquity UPLC®:n käyttöönottoon. Diodirividetektorilla (engl. photodiode array, PDA) havaittiin kuitenkin jatkuvasti laaja piikki, joka peitti suuren osan kromatogrammista. Piikin aiheutti vesipulssi, joka johtui gradientista. Siksi näytteet analysoitiin vain massadetektorilla (engl. mass spectrometry, MS). Analyysit tuottivat lopulta lupaavia tuloksia useiden eri metaboliittien määrittämisessä. Metaboliittien ekstraktion todettiin myös onnistuvan Fluent® 780:lla.

Description

Supervisor

Penttilä, Merja

Thesis advisor

Koponen, Tino

Keywords

DBTL-cycle, glycolic acid, high throughput analysis, high throughput fermentation, LC-MS, metabolite extraction

Other note

Citation

Permanent link to this item

https://urn.fi/URN:NBN:fi:aalto-202008235063

Collections

[dipl] Kemian tekniikan korkeakoulu / CHEM