Production and characterization of the Trichoderma reeser HFBI hydrophobin

Abstract

Työn tutkimusosan tavoitteena oli Trichoderma reesein HFBI-hydrofobiinin puhdistus sekä puhdistetun HFBI-hydrofobiinin karakterisointi. Lisäksi työssä oli tarkoitus kehittää kvantitatiivinen HFBI-hydrofobiinipitoisuuden määritysmenetelmä. Kirjallisuusosassa tarkasteltiin eri hydrofobiinien ominaisuuksia, esiintymistä ja biologista merkitystä sekä vertailtiin tunnettuja hydrofobiinien puhdistusmenetelmiä.

HFBI-hydrofobiinin pitoisuus määritettiin korkean paineen nestekromatografialla (HPLC). Hydrofobiini eluoitiin käänteisfaasikolonnista epälineaarisella 0-60% asetonitriiligradientilla, jossa oli 0,1% trifluorietikkahappoa. Absorbanssia mitattiin aallonpituudella 215 nm. Näytteiden HFBI-pitoisuudet määritettiin piikkien korkeuksien mukaan. Standardina käytettiin tässä työssä puhdistettua HFBI-hydrofobiinia. Menetelmän tarkkuus oli +- 6%.

Puhdistuksen lähtömateriaaliksi valittiin T. reesein homemyseeli. Noin 70% kasvatuksessa tuotetusta HFBI-hydrofobiinista oli homemyseelin pinnalla. HFBI-hydrofobiini puhdistettiin kolmivaiheisella puhdistusmenetelmällä. HFBI uutettiin myseelin pinnalta 100 mM Tris / HCl pH 9,0, 1% SDS -liuoksella. Suurin osa SDS:sta poistettiin uutoksesta saostamalla. Uutos puhdistettiin hydrofobisiin vuorovaikutuksiin perustuvalla kromatografialla (Phenyl Sepharose FF). Saanto uuttoliuoksesta oli 60% HFBI-hydrofobiinia. Puhdistettu HFBI-preparaatti sisälsi 2,8 g 15 dm[3] kasvatuksen HFBI-hydrofobiinia.

Puhdistettua HFBI-hydrofobiinia karakterisoitaessa selvitettiin, että HFBI ei ole glyko- eikä lipoproteiini. Sen rakenne ei ole resistentti proteinaasikäsittelyille. HFBI-hydrofobiinipreparaatti oli SDS-PAGE:n ja HPLC:n mukaan lähes puhdas. Preparaatissa oli myös T. reesein tuottamaa keltaista väriä. Preparaatti sisälsi massaspektrometrin mukaan kaksi komponenttia, joiden molekyylipainot olivat 7,5 kDa ja 7,3 kDa. HFBI-hydrofobiinin teoreettinen molekyylipaino on 7,5 kDa. Molekyylipainon perusteella on mahdollista, että pienempi komponentti on HFBI-hydrofobiini, jonka aminohappoketjun N-päästä puuttuu kaksi aminohappoa. Preparaatin aminohappoanalyysillä määritetty aminohappokoostumus vastasi HFBI-hydrofobiinin aminohappokoostumusta. Tulosten mukaan T. reesein homemyseelistä puhdistettu proteiini on HFBI-hydrofobiinia.