Construction, characterization and optimization of an in vitro metabolic pathway

Loading...
Thumbnail Image
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Kemian tekniikan korkeakoulu | Master's thesis
Date
2017-02-13
Department
Major/Subject
Biotekniikka ja elintarviketekniikka
Mcode
KE3002
Degree programme
Master's Programme in Chemical, Biochemical and Materials Engineering
Language
en
Pages
117
Series
Abstract
The objective of this master’s thesis, as a part of the Synthetic Biology Research Programme (FinSynBio) at the Academy of Finland, was the expression, purification and characterization of two enzymes involved in a synthetic non-phosphorylative in vitro metabolic pathway. Additionally, the aim of this work was to validate the feasibility of this synthetic non-phosphorylative metabolic pathway experimentally, by combining these two enzymes with other relevant pathway enzymes to construct a synthetic in vitro metabolic pathway for the production of a biotechnologically relevant compound, glycolic acid, starting from D-xylose. A xylonolactonase from Caulobacter crescentus and an aldehyde dehydrogenase from Escherichia coli were expressed in E. coli as the corresponding genes xylC and aldA in the pBAT4 plasmid. The encoded proteins were purified using column chromatography. To determine lactonase activity, the decolorization of p-nitrophenol, caused by the production of sugar acids, was followed spectrophotometrically, and the disappearance of the lactone structure was followed using circular dichroism spectroscopy. To determine de-hydrogenase activity, the formation of NADH was followed spectrophotometrically. Metabolic pathway activity was also coupled to the formation of NADH in the last step, catalyzed by Ec AldA. Highest xylonolactonase activity was measured in alkaline conditions, in the presence of the divalent metal ion Zn2+. The presence of Zn2+ was shown to alter the secondary structure of Cc XylC, and the presence of zinc in storage buffer was shown have a deleterious effect on lactonase activity. Highest dehydrogenase activity was measured in alkaline conditions, in the presence of DTT, a reducing and a chelating agent. Implications of substrate inhibition were observed at substrate concentrations of 0.5 mM and above. The presence of Zn2+ was shown to be deleterious to Ec AldA activity. In the case of the in vitro pathway, the Cc XylC lactonase was shown increase the overall rate of glycolic acid formation in pH 7. In pH 8, the inclusion of the lactonase was shown to have little effect. In this work, we expressed, purified, and characterized the xylonolactonase XylC from C. crescentus and the aldehyde dehydrogenase AldA from E. coli. Feasibility of the synthetic metabolic pathway was validated experimentally by demonstrating the production of glycolic acid from D-xylonolactone and D-xylonate in vitro. The results in this thesis can be used to optimize and understand the glycolic acid synthesis process in vitro and in vivo. This pathway can also be extended for the production of biotechnologically relevant compounds, such as ethylene glycol, lactic acid, or citric acid cycle derivatives from D-xylose.

Tämän diplomityön tavoitteena, osana Suomen Akatemian Synteettisen biologian FinSynBio-tutkimusohjelmaa, oli kahden synteettiseen, fosforyloimattomaan in vitro metaboliareittiin liittyvän entsyymin ekspressointi, eristys ja karakterisointi. Työn päämääränä oli synteettisen, fosforyloimattoman in vitro metaboliareitin toteutettavuuden kokeellinen validointi yhdistämällä edellämainitut kaksi entsyymiä muiden oleellisten metaboliareittientsyymien kanssa rakentaen synteettinen in vitro metaboliareitti bioteknologisesti merkittävän yhdisteen, glykolihapon, tuottamiseksi D-ksyloosista. Ksylonolaktonaasi Caulobacter crescentus -bakteerista ja aldehydidehydrogenaasi Escherichia coli-bakteerista ekspressoitiin E. coli -bakteerissa vastaavina xylC ja aldA geeneinä pBAT4-plasmidissa. Geenejä vastaavat proteiinit eristettiin pylväskromatografian avulla. Laktonaasiaktiivisuuden määrittämiseksi p-nitrofenolin muuttumista värittömäksi sokerihappojen muodostumisen seurauksena seurattiin spektrofotomerisesti, ja laktonirakenteen katoamista seurattiin sirkulaaridikroismispektroskopian avulla. Dehydrogenaasiaktiivisuuden määrittämiseksi NADH:n muodostumista seurattiin spektrofotometrisesti. Metaboliareittiaktiivisuuden määrittämiseksi NADH:n muodostumista reitin viimeisen entsyymin, Ec AldA:n katalysoimana seurattiin spektrofotometrisesti. Korkein ksylonolaktonaasiaktiivisuus mitattiin emäksisissä olosuhteissa, kaksiarvoisen metalli-ionin Zn2+ ollessa läsnä reaktioseoksessa. Zn2+ -ionien läsnäolon havaittiin aiheuttavan muutoksia Cc XylC:n sekundaarirakenteessa, ja entsyymiaktiivisuuden havaittiin laskevan varastoitaessa entsyymi sinkkiä sisältävässä puskurissa. Korkein dehydrogenaasiaktiivusus mitattiin emäksisissä olosuhteissa, pelkistävän ja kelatoivan yhdisteen, DTT:n ollessa läsnä reaktioseoksessa. Merkkejä substraatti-inhibitiosta havaittiin käytettäessä 0.5 mM ja korkeampia substraattikonsentraatioita. Zn2+ -ionien läsnäolon havaittiin olevan haitallista Ec AldA aktiivisuudelle. In vitro -reitin tapauksessa Cc XylC laktonaasin osoitettiin parantavan glykolihapon tuottoa pH:ssa 7. pH:ssa 8 laktonaasin vaikutus glykolihapon tuottoon oli puolestaan vähäinen. Tässä työssä ekspressoitiin, eristettiin ja karakterisoitiin ksylonolaktonaasi XylC C. crescentus -bakteerista ja aldehydidehydrogenaasi AldA E. coli -bakteerista. Synteettisen metaboliareitin toteuttavuus validoitiin kokeellisesti osoittamalla glykolihapon tuotto D-ksylonolaktonista ja D-ksylonaatista in vitro. Tämän työn tuloksia voidaan käyttää fosforyloimattoman glykolihapposynteesin ymmärtämiseen ja optimoimiseen in vitro ja in vivo. Synteettistä metaboliareittiä voidaan jatkaa muiden bioteknologisesti merkittävien tuotteiden, kuten etyleeniglykolin, maitohapon, tai sitruunahapposyklijohdannaisten tuottamiseksi D-ksyloosista.
Description
Supervisor
Frey, Alexander
Thesis advisor
Koivula, Anu
Boer, Harry
Keywords
synthetic pathway, in vitro, enzyme cascade, sugar acid, lactonase, dehydrogenase
Other note
Citation