Characterization and engineering of hexaric and hexuronic acid pathways in fungal microorganisms

dc.contributorAalto-yliopistofi
dc.contributorAalto Universityen
dc.contributor.advisorRichard, Peter
dc.contributor.authorWang, Jasmin
dc.contributor.schoolKemian tekniikan korkeakoulufi
dc.contributor.supervisorFrey, Alexander
dc.date.accessioned2016-06-17T12:34:09Z
dc.date.available2016-06-17T12:34:09Z
dc.date.issued2016-06-14
dc.description.abstractCitrus juice production and sugar beet processing produce pectin-rich residues which are mainly used as animal feed. Food industry also uses pectin produced from citrus peel as gelling agent. The main constituent of pectin is D-galacturonic acid. The filamentous fungus Aspergillus niger is naturally capable of hydrolyzing pectin and it can catabolize galacturonic acid through pyruvate and glycerol. Hence, pectin-rich residues could provide a cost effective alternative for producing value-added products, for example, galactaric acid which has many potential applications in polymer synthesis and as a platform chemical. Galactaric acid could be produced by engineered A. niger. However, the acid is catabolized by the mould resulting in the lowered yield. This catabolic pathway of galactaric acid is still not known. The objectives of the Master’s thesis were to unravel the pathway for galactaric acid catabolism, characterize the proteins and construct a galactaric acid producing A. niger strain. In this study, eight potential genes involved in the catabolic pathways were investigated. The genes were deleted from the wild-type strain ATCC 1015 utilizing CRISPR/Cas9 technology, and galactaric acid utilization of the resulting mutant strains was investigated. To the best of my knowledge, this is the first report of using in vitro gRNA successfully in A. niger for targeted gene deletion by the CRISPR/Cas9 genome editing tool. Three of the investigated genes, 39114, 1090836 and 1121140, were concluded to be involved in the pathway. Blocking galacturonic and galactaric acid pathways by deleting genes gaaA and 39114, respectively, and expressing a heterologous gene udh, A. niger ΔgaaA udh Δ39114 was able to produce 4.3 ± 0.2 g/l galactaric acid from galacturonic acid in submerged fermentation. In solid-state and submerged fermentation, the strain produced 15.4 ± 0.6 and 82.3 ± 3.9 mg galactaric acid/g citrus processing waste on dry mass basis, respectively.en
dc.description.abstractSitrusmehun tuotannossa ja sokerijuurikkaan käsittelyssä muodostuu runsaasti pektiiniä sisältävää jätettä, jota pääsääntöisesti käytetään rehuna. Elintarviketeollisuus käyttää myös sitrushedelmien kuorista valmistettua pektiiniä hyytelöimisaineena. Pektiinin pääkomponentti on D-galakturonihappo. Filamenttihome Aspergillus niger kykenee luonnostaan hydrolysoimaan pekniitiä ja katabolisoimaan galakturonihapon pyruvaatiksi ja glyseroliksi. Näin ollen runsaasti pektiiniä sisältävät jätteet voisivat tarjota taloudellisesti kannattavan vaihtoehdon arvokkaiden tuotteiden, esimerkiksi galaktaarihapon, valmistukselle. Galaktaarihapolla on monia potentiaalisia sovelluksia polymeerisynteesissä. Geenimuokatulla A. niger –homeella voidaan tuottaa galaktaarihappoa, mutta home myös kykenee katabolisoimaan galaktaarihappoa, mikä alentaa saantoa. Galaktaarihapon kataboliareitti A. niger –homeessa ei kuitenkaan ole tunnettu. Tämän diplomityön tarkoituksena oli selvittää galaktaarihapon kataboliareitti, karakterisoida reittiin kuuluvat entsyymit ja konstruoida galaktaarihappoa tuottava A. niger –kanta. Tässä työssä tutkittiin kahdeksan geeniä, jotka ovat mahdollisesti osana galaktaarihapon kataboliareittiä. Nämä geenit deletoitiin villityyppikannasta ATCC 1015 käyttämällä CRISPR/Cas9-teknologiaa. Parhaimman tiedon mukaan tämä on ensimmäinen raportti, jossa on käytetty in vitro gRNA:ta onnistuneesti geenien deletoimiseen CRISPR/Cas9 genomin muokkaustekniikalla. Kolme tutkituista geeneistä, 39114, 1090836 ja 1121140, todettiin olevan osana kataboliareittiä. Deletoimalla geenit gaaA ja 39114, jotka ovat galakturoni- ja galaktaarihapon kataboliareiteissä, ja ekpressoimalla heterologinen uhd geeni A. niger –homeessa, saatiin ΔgaaA udh Δ39114-kanta, joka tuotti nestekasvatuksessa 4.3 ± 0.2 g/l galaktaarihappoa galakturonihaposta. Kiintoaine- ja nestekasvatuksessa käytettäessä sitrushedelmien kuorijätettä substraattina kanta tuotti 15.4 ± 0.6 ja 82.3 ± 3.9 mg galaktaarihappoa/g sitrushedelmien kuorijäte kuivapainona.fi
dc.format.extent70+11
dc.format.mimetypeapplication/pdfen
dc.identifier.urihttps://aaltodoc.aalto.fi/handle/123456789/20912
dc.identifier.urnURN:NBN:fi:aalto-201606172520
dc.language.isoenen
dc.locationPKfi
dc.programmeKEM - Kemian tekniikan koulutusohjelmafi
dc.programme.majorBiotekniikka ja elintarviketekniikkafi
dc.programme.mcodeKE3002fi
dc.rights.accesslevelopenAccess
dc.subject.keywordD-galacturonic aciden
dc.subject.keywordgalactaric aciden
dc.subject.keywordcitrus peelen
dc.subject.keywordfilamentous fungien
dc.subject.keywordAspergillus nigeren
dc.subject.keywordCRISPR/Cas9en
dc.titleCharacterization and engineering of hexaric and hexuronic acid pathways in fungal microorganismsen
dc.titleHeksaari- ja heksuronihapporeittien karakterisointi ja muokkaus mikrosienissäfi
dc.typeG2 Pro gradu, diplomityöfi
dc.type.okmG2 Pro gradu, diplomityö
dc.type.ontasotMaster's thesisen
dc.type.ontasotDiplomityöfi
dc.type.publicationmasterThesis
local.aalto.idinssi53952
local.aalto.openaccessyes
Files
Original bundle
Now showing 1 - 1 of 1
No Thumbnail Available
Name:
master_Wang_Jasmin_2016.pdf
Size:
2.74 MB
Format:
Adobe Portable Document Format