Design and synthesis of a custom ssDNA scaffold for functional DNA origami devices
No Thumbnail Available
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Kemian tekniikan korkeakoulu |
Master's thesis
Author
Date
2024-06-17
Department
Major/Subject
Biosystems and Biomaterials Engineering
Mcode
CHEM3028
Degree programme
Master’s Programme in Life Science Technologies
Language
en
Pages
74+8
Series
Abstract
DNA is an intriguing biomaterial in addition to its role as a genetic carrier. DNA can be used as a construction material to form nanoscale structures. In DNA origami technique, DNA is folded into almost arbitrary shapes from a long single-stranded scaffold strand and hundreds of shorter staple strands. The scaffold plays an important role in DNA origami design, as it is the largest component of the origami structure, and its length and sequence define the size of the origami and binding of other molecules. Hence, to expand the size and to incorporate a custom sequence to the origami, the aim of this thesis is to design and synthesize a functional scaffold with tailored size and sequence. Different scaffold production methods are analyzed and compared in the literature part to select the most suitable synthesis method for the experiments. In brief, bacteriophage-based scaffold production methods typically have higher yields, whereas enzymatic and PCR-based methods help manipulate the scaffold sequences with greater ease. In this thesis, PCR-based methods were used to create a functional DNA origami scaffold with a defined sequence. Scaffold production was optimized using two promising enzymatic production methods: asymmetric PCR and T7 exonuclease based enzymatic digestion. Asymmetric PCR production worked with all the PCR templates used, whereas enzymatic digestion failed to produce expected single-stranded scaffold DNA. A custom DNA sequence was inserted into the scaffold and successful incorporation was verified by Sanger DNA sequencing. The synthesized scaffold DNA was folded into 24-helix bundle DNA origami structures and the folding was verified with transmission electron microscopy. Custom DNA origami scaffolds provide an opportunity to functionalize various molecules and overcome the size limitations of DNA origami structures. Although the production methods still need to be improved to produce scaffolds at a larger scale, custom scaffolds will greatly expand utility and applicability of DNA origami technique.DNA on kiehtova biomateriaali. Se ei ainoastaan sisällä eliöiden geneettistä materiaalia, vaan sitä voidaan käyttää myös rakennusmateriaalina nanoskaalan rakenteiden luomisessa. DNA-origamitekniikassa DNA voidaan laskostaa lähes mielivaltaisiin muotoihin pitkästä yksijuosteisesta templaattijuosteesta ja sadoista lyhyemmistä liitosjuosteista. Templaattijuosteella on tärkeä rooli DNA-origamien suunnittelussa, sillä se on DNA-origamirakenteen suurin komponentti ja sen pituus ja sekvenssi määrittävät sekä origamirakenteen koon että muiden molekyylien sitoutumisen. Tämän työn tavoitteena on suunnitella ja syntetisoida funktionaalinen, kooltaan ja sekvenssiltään räätälöity templaattijuoste, jonka avulla voidaan origamin kokoa suurentaa ja sisällyttää siihen kustomoitu sekvenssi. Kirjallisuuskatsauksessa analysoidaan ja vertaillaan erilaisia templaattijuosteen tuotantomenetelmiä sopivimman synteesimenetelmän valitsemiseksi kokeelliseen osuuteen. Yhteenvetona voidaan todeta, että bakteriofagi-pohjaiset menetelmät johtavat yleensä parempaan saantoon, kun taas entsymaattiset ja PCR-pohjaiset menetelmät mahdollistavat templaattisekvenssien helpomman manipuloinnin. Tässä diplomityössä käytettiin PCR-pohjaisia metodeja funktionaalisen ja sekvenssiltään kustomoidun DNA-origamitemplaatin tuottamiseen. Templaattijuosteen tuottaminen optimoitiin käyttäen kahta lupaavaa entsymaattista tuotantomenetelmää: asymmetristä PCR:ää ja entsymaattista hajotusta T7-eksonukleaasin avulla. Asymmetrinen PCR toimi hyvin kaikilla käytetyillä PCRtemplaateilla, kun taas entsymaattisella hajotuksella ei onnistuttu tuottamaan DNA-origamiin tarvittavaa yksijuosteista templaattia. Kustomoitu DNA-sekvenssi lisättiin templaattijuosteeseen ja tämä validoitiin Sangerin DNA-sekvensoinnilla. Syntetisoitu templaattijuoste laskostettiin 24 heliksistä koostuviksi kimppumaisiksi DNA-origamirakenteiksi ja laskostuminen todennettiin läpäisyelektronimikroskopialla. Räätälöidyt DNA-origamitemplaattijuosteet mahdollistavat erilaisten molekyylien funktionalisoinnin ja DNA-origamien muodostamisen ilman kokorajoituksia. Vaikka laajan skaalan tuotantomenetelmiä on edelleen kehitettävä, kustomoidut templaattijuosteet parantavat huomattavasti DNA-origamitekniikan käytettävyyttä ja sovellettavuutta.Description
Supervisor
Kuzyk, AntonThesis advisor
Natarajan, AshwinKeywords
DNA origami, DNA scaffold, asymmetric PCR, enzymatic digestion
