aalto1 untyped-item.component.html
Phosphorus-31 NMR spectroscopy in metabolomics and carbon-13 tracer studies of yeast Saccharomyces cerevisiae
Loading...
URL
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Helsinki University of Technology |
Master's thesis
Electronic archive copy is available via Aalto Thesis Database.
Checking the digitized thesis and permission for publishing
Instructions for the author
Instructions for the author
Location:
Authors
Date
Department
Major/Subject
Mcode
Kem-70
Degree programme
Language
en
Pages
v + 149 s. + liitt. 2
Series
Abstract
Työn kirjallisuusosassa tarkasteltiin Saccharomyces cerevisiae hiivan hiilimetabolian muokkausta tavoitteena tehokas bioetanolin tuotanto heksooseja ja pentooseja sisältävistä raaka-aineista.
Lisäksi esiteltiin NMR spektroskopian perusteita, yksi- ja kaksiulotteisia NMR menetelmiä ja <sup>31</sup>P NMR spektroskopian erityispiirteet.
Metabolomiikan ja metaboliafluksien analysoinnin merkitystä muokattujen kantojen metabolian karakterisoinnissa käsiteltiin.
Myös metabolomiikassa, systeemibiolologiassa ja metaboliafluksianalytiikassa käytettyjä menetelmiä ja tutkimuksen nykytilaa tarkasteltiin.
Työn kokeellinen osa aloitettiin mittaamalla yksiulotteisia <sup>31</sup>P NMR spektrejä hiivaekstrakteista.
Sitten tutkittiin sokerifosfaattien, jotka ovat glykolyysin ja pentoosifosfaatti -reitin välituotteita, fosfori-31 kemiallisten siirtymien pH-riippuvuutta.
Määritettiin optimaaliset mittausolosuhteet, pH ja lämpötila, sokerifosfaattien yksiulotteiselle <sup>31</sup>P NMR spektroskopialle.
Todettiin, että alhaisissa mittauslämpötiloissa saatiin optimaaliset signaalien viivamuodot ja paras resoluutio saavutettiin neutraalissa pH:ssa.
Sokerifosfaattimolekyylien protonien kemiallisia siirtymiä ja täydellisten spinsysteemien signaalikuvioita tutkittiin yksiulotteisilla <sup>1</sup>H NMR mittauksilla ja kaksiulotteisilla DQF-COSY ja TOCSY mittauksilla.
Metaboliafluksianalytiikassa, hiili-13 leimauskokeissa muodostuneiden positionaalisten hiili-13 rikastusasteiden mittaamiseen kehitettiin kaksiulotteinen heteronukleaarinen NMR menetelmä, <sup>1</sup>H-<sup>31</sup>P HSQC-TOCSY, joka korreloi fosfori-31 kemialliset siirtymät fosforiin kytkeytyneen protonin koko spinsysteemin protoneiden kemiallisten siirtymien kanssa.
Adiabaattinen TOCSY spin-lukko lisättiin menetelmään, jotta saavutettaisiin parempi viivamuoto ja yhteensopivuus Varianin nanoproben kanssa.
Adiabaattisella <sup>1</sup>H-<sup>31</sup>P HSQC-TOCSY menetelmällä, <sup>1</sup>H-<sup>31</sup>P HSQC-AD-TOCSY menetelmällä, mitattiin fosforia sisältäviä yhdisteitä hiivan metaboliittiekstraktista.
Resoluutiota parannettiin kapealla sokerifosfaattien fosfori-31 taajuusalueella lisäämällä menetelmään sokerifosfaateille selektiiviset 180° inversiopulssit.
Selektiivisellä <sup>1</sup>H-<sup>31</sup>P HSQC-AD-TOCSY menetelmällä mitattiin sokerifosfaatteja suoraan hiivan metaboliittiekstrakteista.
Hiili-l3 leimauskokeet tehtiin S. cerevisiae kannoilla, joissa oli xyloosireitti, hiilenlähteenä [2-<sup>31</sup>C]-D- glukoosi.
Ensimmäisen käytetyn kannan prototrofisuus konstruktio oli epästabiloitunut ja se kasvoi heikosti alustalla, jossa ei ollut aminohappoja.
Jäljelle jäänyt [2-<sup>13</sup>C]-D-glukoosi puhdistettiin alustasta ja sitä käytettiin hiilenlähteenä toisessa leimauskokeessa, jossa käytettiin toista kloonia edellisestä S cerevisiae kannasta.
Perkloorihappomentelmää käytettiin metabolian pysäyttämiseen ja metaboliittien uuttamiseen.
Yhtään aiemmin tutkittua sokerifosfaattia ei tunnistettu jälkimmäisestä leimatusta hiivan metaboliittiekstraktista NMR kokeissa.