Phosphorus-31 NMR spectroscopy in metabolomics and carbon-13 tracer studies of yeast Saccharomyces cerevisiae

No Thumbnail Available
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Helsinki University of Technology | Diplomityö
Checking the digitized thesis and permission for publishing
Instructions for the author
Author
Date
2004
Department
Kemian tekniikan osasto
Major/Subject
Bioprosessitekniikka
Mcode
Kem-70
Degree programme
Language
en
Pages
v + 149 s. + liitt. 2
Series
Abstract
Työn kirjallisuusosassa tarkasteltiin Saccharomyces cerevisiae hiivan hiilimetabolian muokkausta tavoitteena tehokas bioetanolin tuotanto heksooseja ja pentooseja sisältävistä raaka-aineista. Lisäksi esiteltiin NMR spektroskopian perusteita, yksi- ja kaksiulotteisia NMR menetelmiä ja <sup>31</sup>P NMR spektroskopian erityispiirteet. Metabolomiikan ja metaboliafluksien analysoinnin merkitystä muokattujen kantojen metabolian karakterisoinnissa käsiteltiin. Myös metabolomiikassa, systeemibiolologiassa ja metaboliafluksianalytiikassa käytettyjä menetelmiä ja tutkimuksen nykytilaa tarkasteltiin. Työn kokeellinen osa aloitettiin mittaamalla yksiulotteisia <sup>31</sup>P NMR spektrejä hiivaekstrakteista. Sitten tutkittiin sokerifosfaattien, jotka ovat glykolyysin ja pentoosifosfaatti -reitin välituotteita, fosfori-31 kemiallisten siirtymien pH-riippuvuutta. Määritettiin optimaaliset mittausolosuhteet, pH ja lämpötila, sokerifosfaattien yksiulotteiselle <sup>31</sup>P NMR spektroskopialle. Todettiin, että alhaisissa mittauslämpötiloissa saatiin optimaaliset signaalien viivamuodot ja paras resoluutio saavutettiin neutraalissa pH:ssa. Sokerifosfaattimolekyylien protonien kemiallisia siirtymiä ja täydellisten spinsysteemien signaalikuvioita tutkittiin yksiulotteisilla <sup>1</sup>H NMR mittauksilla ja kaksiulotteisilla DQF-COSY ja TOCSY mittauksilla. Metaboliafluksianalytiikassa, hiili-13 leimauskokeissa muodostuneiden positionaalisten hiili-13 rikastusasteiden mittaamiseen kehitettiin kaksiulotteinen heteronukleaarinen NMR menetelmä, <sup>1</sup>H-<sup>31</sup>P HSQC-TOCSY, joka korreloi fosfori-31 kemialliset siirtymät fosforiin kytkeytyneen protonin koko spinsysteemin protoneiden kemiallisten siirtymien kanssa. Adiabaattinen TOCSY spin-lukko lisättiin menetelmään, jotta saavutettaisiin parempi viivamuoto ja yhteensopivuus Varianin nanoproben kanssa. Adiabaattisella <sup>1</sup>H-<sup>31</sup>P HSQC-TOCSY menetelmällä, <sup>1</sup>H-<sup>31</sup>P HSQC-AD-TOCSY menetelmällä, mitattiin fosforia sisältäviä yhdisteitä hiivan metaboliittiekstraktista. Resoluutiota parannettiin kapealla sokerifosfaattien fosfori-31 taajuusalueella lisäämällä menetelmään sokerifosfaateille selektiiviset 180° inversiopulssit. Selektiivisellä <sup>1</sup>H-<sup>31</sup>P HSQC-AD-TOCSY menetelmällä mitattiin sokerifosfaatteja suoraan hiivan metaboliittiekstrakteista. Hiili-l3 leimauskokeet tehtiin S. cerevisiae kannoilla, joissa oli xyloosireitti, hiilenlähteenä [2-<sup>31</sup>C]-D- glukoosi. Ensimmäisen käytetyn kannan prototrofisuus konstruktio oli epästabiloitunut ja se kasvoi heikosti alustalla, jossa ei ollut aminohappoja. Jäljelle jäänyt [2-<sup>13</sup>C]-D-glukoosi puhdistettiin alustasta ja sitä käytettiin hiilenlähteenä toisessa leimauskokeessa, jossa käytettiin toista kloonia edellisestä S cerevisiae kannasta. Perkloorihappomentelmää käytettiin metabolian pysäyttämiseen ja metaboliittien uuttamiseen. Yhtään aiemmin tutkittua sokerifosfaattia ei tunnistettu jälkimmäisestä leimatusta hiivan metaboliittiekstraktista NMR kokeissa.
Description
Supervisor
Leisola, Matti
Thesis advisor
Maaheimo, Hannu
Keywords
Other note
Citation
Permanent link to this item
https://urn.fi/URN:NBN:fi:aalto-2020120450375
Collections
[dipl] Teknillinen korkeakoulu / TKK