Rekombinanttiksylanaasin puhdistus ja karakterisointi

No Thumbnail Available
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Helsinki University of Technology | Diplomityö
Checking the digitized thesis and permission for publishing
Instructions for the author
Date
1997
Major/Subject
Biokemia
Mcode
Kem-30
Degree programme
Language
fi
Pages
ix + 107 s. + liitt.
Series
Abstract
Ksylanaasit ovat luonnossa esiintyviä entsyymejä, jotka hydrolysoivat kasvien soluseinämien hemiselluloosaa, ksylaania. Niitä voidaan käyttää sellun valkaisun tehostamisessa, jolloin valkaisussa käytettyjen kemikaalien määrää voidaan vähentää. Koska teolliset valkaisuprosessit tapahtuvat korkeassa lämpötilassa ja pH:ssa, tarvitaan termostabiileja, alkaalisissa olosuhteissa toimivia ksylanaaseja. Tässä työssä puhdistettiin kromatografisin proteiininpuhdistusmenetelmin Trichoderma reesei homeessa tuotettua Microtetraspora flexuosan AM35 ksylanaasia, joka kuuluu perheen 11 (G) ksylanaaseihin. AM35 ksylanaasi muodostuu entsyymin katalyyttisestä ydinosasta ja ksylaaniin sitoutuvasta C-terminaaliosasta, joita erottaa liitosalue. Eri T. reesei kantojen oli havaittu tuottavan eri kokoisia AM35 ksylanaaseja, ja kasvuliuoksessa olevan ksylanaasin koko riippui myös kasvatusolosuhteista. Työssä puhdistettiin kantojen A ja B kasvuliemistä kolme eri kokoista ksylanaasifragmenttia, joiden koot olivat 33,4 kDa, 23,8 kDa ja 22,0 kDa. Lisäksi puhdistettiin M. flexuosa ALKO3685 kasvuliemestä villityypin AM35 ksylanaasia, jonka kooksi määritettiin 32,8 kDa. Proteiinien N-terminaalien. tarkkojen massojen ja AM35 ksylanaasin sekvenssin perusteella pääteltiin lyhyiden fragmenttien katkaisukohtien olevan ksylanaasin ns. liitosalueella, joten niissä ei ollut ksylaaniin sitoutuvaa C-terminaaliosaa. 23,8 kDa fragmentti sisälsi entsyymin ydinosan ja osan liitosalueesta, 22,0 kDa fragmentti pelkän ydinosan. Puhdistetut rekombinanttiproteiinit karakterisoitiin ja niiden ominaisuuksia verrattiin villityypin AM35 ksylanaasiin. Karakterisoitavia ominaisuuksia olivat mm. spesifinen aktiivisuus, stabiilisuus, pH- ja lämpötilariippuvuus, entsymaattiset ominaisuudet ja sellun valkaisua tehostavat ominaisuudet. Ksylanaasiaktiivisuuksien optimiolosuhteet olivat alueella pH 5...6, 70...80°C. Fragmentit 23,8 kDa ja 22,0 kDa erosivat kineettisiltä ominaisuuksiltaan (K_M, V_(max)) täyspitkistä ksylanaaseista: niiden K_M:n arvot olivat noin 2,5 kertaa suuremmat kuin täyspitkien ksylanaasien ja V_(max), arvot olivat myös suuremmat. Myös lämpöstabiilisuuksissa oli huomattavia eroja: lyhyiden fragmenttien aktiivisuuden puoliintumisajat 80°C lämpötilassa olivat jopa kymmenkertaiset verrattuna täyspitkiin ksylanaaseihin. Stabiilein lämpötilassa 80°C oli 23,8 kDa fragmentti. Valkaisukokeissa pelkän ydinosan ja liitosaluetta omaava 23,8 kDa fragmentti tehosi yhtä hyvin kuin ksylaaniin sitoutuvan domeenin omaava täyspitkä ksylanaasi. Fragmentti 22,0 kDa, jossa ei ollut lainkaan ksylaaniin sitoutuvaa domeenia eikä liitosaluetta, oli näissä olosuhteissa tehottomin. Tulokset viittaavat siihen, että tämän ksylanaasin ksylaaniin sitoutuva domeeni ei ole oleellinen ksylanaasin kyvylle tehostaa sellumassan valkaisua. Lisäksi näyttää siltä, että täyspitkä ksylanaasi kestää korkeita lämpötiloja huonommin kuin lyhyemmät fragmentit.
Description
Supervisor
Laakso, Simo
Thesis advisor
Fagerström, Richard
Keywords
Other note
Citation