Differentiation of hESC to definitive endoderm by 3D culture methods: towards adult hepatocytes

No Thumbnail Available
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Kemian tekniikan korkeakoulu | Master's thesis
Ask about the availability of the thesis by sending email to the Aalto University Learning Centre oppimiskeskus@aalto.fi
Date
2017-10-23
Department
Major/Subject
Biosystems and Biomaterials Engineering
Mcode
CHEM3028
Degree programme
Master’s Programme in Life Science Technologies
Language
en
Pages
82 + 7
Series
Abstract
The aim of this Thesis is the development of three-dimensional culture methods for robust differentiation of human pluripotent stem cells (hPSC) to definitive endoderm (DE), an intermediate stage in the differentiation pathway towards hepatic and pancreatic cell fates. The objective is to induce DE in sufficient quantities to enable robust continued differentiation to functional hepatocytes, the main metabolizing cells of the liver. These cells hold immense potential in regenerative medicine, pharmaceutical development and tissue engineering. During this Thesis work, human embryonic stem cells were first grown on Matrigel, and then transferred to nanofibrillar cellulose (NFC) hydrogel for 3D spheroid structure formation. These spheroids were then differentiated to DE in NFC hydrogel culture with three differing supplementation schemes, and in super-low binding suspension culture with two differing supplementation schemes. The supplementation schemes were designed based on the current knowledge of signaling pathways affecting embryonic development (Nodal/Activin, BMP and Wnt), as well as the latest culturing methods described in literature. Results were analyzed by fluorescence-activated cell sorting (FACS) and quantitative polymerase chain reaction (qPCR). Additional viability characterization was carried out by Trypan Blue staining and morphology monitoring by phase contrast microscopy. The growth factor permeation within the NFC hydrogel was additionally modelled with Matlab scripts estimating diffusion according to Fick's second law and the Stokes-Einstein relation. NFC was also rheologically characterized for modelling purposes. Resulting yields of 69.9\% CXCR4-positive cells were acquired by NFC gel culture, and these yields were further improved by suspension culture methods leading to 15-fold increases in HNF3beta, and 37-fold increases in SOX17 in reference to NFC culture methods. In other words, the spheroids derived with protocols described in this Thesis potentially contained one of the most homogeneous DE populations found in literature.

Tämän diplomityön tavoitteena on kolmiulotteisten kasvatusmenetelmien kehittäminen ihmisen pluripotenttien kantasolujen (hPSC) erilaistamiseksi definitiiviseksi endodermiksi (DE). Tavoitteena on DE-solujen erilaistaminen sellaisissa määrin, että näiden populaation homogeenisuus riittää jatkettuihin erilaistamiskokeisiin, joissa lopputuloksena tuotetaan toimintakykyisiä hepatosyyttejä. Hepatosyytit ovat maksan merkittävimpiä metaboloivia soluja, ja niiden sovelluskohteet regeneratiivisessa lääketieteessä, lääkekehityksessä, ja kudostekniikassa ovat huomattavan laajat. Diplomityön aikana ihmisen embryoottisia kantasoluja ylläpidettiin ensin Matrigel-kasvatusalustalla, minkä jälkeen ne siirrettiin nanofibrillaariseen selluloosaan (NFC), jossa solut muodostivat kantasolusferoideja. Näiden sferoidien erilaistamiseen sovellettiin kahta eri 3D-viljelymentelmää, eli hydrogeeli- ja suspensiokasvatusmenetelmää, sekä useita eriäviä kasvuainekäsittelyjä. Kasvuainekäsittelyt toteutettiin perustuen viimeisipmään tietämykseen kantasolujen signaloinnista (Nodal/aktiviini, BMP, Wnt). Tulokset analysoitiin hyödyntäen fluoresenssilla aktivoituvaa solulajittelu-sytometriaa (FACS), sekä kvantitatiivista polymeraasiketjureaktiota (qPCR). Tämän lisäksi solujen elinkelpoisuutta seurattiin Trypan Blue -värjäyksellä, sekä valomikroskopian keinoin. Kasvuaineiden diffuusiota mallinnettiin omatekoisella Matlab-mallilla, joka perustui Fickin toiseen lakiin ja Stokes-Einstein relaatioon. Tähän tarkoitukseen NFC:tä karakterisoidaan reologisin mittauksin. Lopputuloksena saatiin 69.9\% CXCR4-positiivisia soluja NFC geelikasvatuksessa, ja näitä saantoja nostettiin vielä korkeammaksi suspensiokasvatuksessa. Suspensiosolukasvatus sai aikaan 15-kertaisen nousun HNF3beta-transkriptiofaktorin ekspressiossa, ja 37-kertaisen nousun SOX17-transkriptiofaktorin ekspressiossa verrattuna geelikasvatukseen. Tämän diplomityön aikana tuotetut DE-sferoidit ovat näinollen yksiä homogeenisimmisista 3D-kasvatusmetodein tuotetuista DE-aggregaateista, joita kirjallisuudessa on raportoitu.
Description
Supervisor
Nordström, Katrina
Thesis advisor
Lou, Yan-Ru
Harjumäki, Riina
Keywords
hESC, definitive endoderm, 3D-culture methods, diffusional modelling, NFC, hepatocytes
Other note
Citation