The importance of oxygen availability in two plant-based bioprocesses: hairy root cultivation and malting
No Thumbnail Available
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Doctoral thesis (article-based)
Checking the digitized thesis and permission for publishing
Instructions for the author
Instructions for the author
Unless otherwise stated, all rights belong to the author. You may download, display and print this publication for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Author
Date
2007-10-12
Major/Subject
Mcode
Degree programme
Language
en
Pages
66, [56]
Series
VTT publications, 652
Abstract
The main aim of this work was to examine the role of oxygen availability in two model processes: the cultivation of Agrobacterium rhizogenes-induced hairy roots of the medicinal plant Egyptian henbane (Hyoscyamus muticus), and barley (Hordeum vulgare) malting. This was accomplished by transferring the vhb gene encoding bacterial haemoglobin (VHb) from Vitreoscilla to H. muticus and to barley with the specific goals of improving the growth and alkaloid production of H. muticus hairy roots and the germination rate of barley. In H. muticus hairy roots, heterologous vhb expression and an increase in aeration both improved the growth, but not the specific hyoscyamine production of the hairy roots. This suggests that oxygen availability may not be a limiting factor in hyoscyamine synthesis. The effect of VHb on the alkaloid profile of H. muticus hairy roots was not identical to that of aeration, indicating that the physiological effects of VHb are probably not related directly to its ability to increase the intracellular effective oxygen concentration. Although VHb production did not have a statistically significant effect on hyoscyamine production due to wide somaclonal variation, the highest production levels were found among the VHb-lines. A problem related to vhb expression was the tendency of hairy roots to dedifferentiate to callus. This effect probably counteracted the positive effects of vhb expression, because root dedifferentiation leads to impaired alkaloid production. Barley plants expressing the vhb gene did not react to oxygen deficiency by increasing the alcohol dehydrogenase (ADH) activity in the roots, unlike the control plants. This could be due to the ability of VHb to supplement the role of ADH in the recycling of NADH and maintaining glycolysis. In contrast to previous findings, we found that constitutive vhb expression did not improve the germination rate of barley kernels. On the contrary, VHb even retarded germination slightly. Moreover, VHb restricted root growth in young barley seedlings. These effects are probably related to the ·NO dioxygenase activity of VHb. Because nitric oxide (NO) has both cytotoxic and stimulating properties, the effect of vhb expression in plants may depend on the level and role of endogenous NO in the conditions studied. In conditions involving excess NO production, such as severe oxygen deficiency, VHb can protect plant cells from the adverse effects of NO. However, in conditions in which NO plays an important role as a signal molecule, such as germination and root growth, vhb expression may even have slightly adverse effects on growth and development. Another aim of the study was to verify the hypothesis that barley embryos suffer from oxygen deficiency in the malting process, regardless of aeration. This was accomplished by studying the effect of aeration on the production of the inducible isoenzymes ADH2 and ADH3, ADH activity, ethanol production and α-amylase activity. Furthermore, the effect of the indigenous microbial community of the barley kernel on embryo oxygen deficiency was studied by modifying the microbial populations in the malting process. Neither aeration nor a reduction in grain microbes alleviated the oxygen deficiency of the barley embryo. An improvement in germination was observed after restriction of bacteria, but this was probably a consequence of facilitated root emergence. Many of the bacterial species dominating in the malting process can produce exopolymeric substances that may form a physical barrier restricting root emergence. A certain degree of oxygen deficiency in the embryo appears to be an inevitable stage in barley germination. The recent results of other research groups showing that NO is produced in plant cells under oxygen deficiency and that NO stimulates seed germination, together with the present results showing that vhb expression slows down barley germination slightly, imply that embryo oxygen deficiency is in fact beneficial or even necessary for germination. Although aeration cannot and need not overcome the oxygen deficiency of the barley embryo, the need for aeration increases as the malting process proceeds. Aeration not only introduces the oxygen needed for the completion of germination, enzyme synthesis and other post-germinative events, but also removes CO2 that would otherwise inhibit modification of the grain.Työn pääasiallinen tavoite oli tutkia hapen roolia kahdessa malliprosessissa: Egyptin villikaalin (Hyoscyamus muticus) juuriviljelmissä sekä ohran (Hordeum vulgare) mallastuksessa. Hapen roolia tutkittiin siirtämällä bakteeri-hemoglobiinia (VHb) koodaava vhb-geeni Vitreoscillasta Egyptin villikaaliin ja ohraan. Geeninsiirron tavoitteena oli parantaa Egyptin villikaalin juuriviljelmien kasvua ja alkaloidituottoa ja nopeuttaa ohran itämistä. Sekä VHb:n tuotto että ilmastus paransivat juuriviljelmien kasvua, mutta eivät vaikuttaneet hyoskyamiinituottoon. Hapen puute ei siis näytä rajoittavan hyoskyamiinisynteesiä. VHb:n vaikutus Egyptin villikaalin alkaloidiprofiiliin poikkesi ilmastuksen vaikutuksesta, mikä viittaa siihen, ettei VHb:n fysiologinen vaikutus perustu pelkästään sen kykyyn nostaa solunsisäistä happikonsentraatiota. Parhaat hyoskyamiinintuottajalinjat löytyivät VHb-linjojen joukosta, vaikka VHb:n tuotto ei suuren hajonnan takia nostanutkaan hyosmyakiinituottoa tilastollisesti merkitsevästi. VHb-linjat olivat kuitenkin vertailukasveja alttiimpia menettämään juurisolukkorakenteensa ja muodostamaan kallusta. Tämä taipumus heikentää VHb-linjojen käyttökelpoisuutta, koska kalluksen alkaloidituotto on selvästi heikompi kuin juurten. VHb:tä tuottavien ohrakasvien juuret eivät vertailukasvien tapaan reagoineet hapen puutteeseen lisäämällä alkoholidehydrogenaasiaktiivisuutta (ADH). Tämä voi johtua VHb:n kyvystä korvata ADH:ta glykolyysin ylläpidossa ja NADH:n kierrätyksessä. Aikaisemmista tutkimuksista poiketen VHb ei nopeuttanut ohran itämistä. VHb jopa hidasti itämistä hieman. VHb rajoitti myös nuorten ohrataimien juurten kasvua. Nämä vaikutukset liittyvät todennäköisesti VHb:n NO dioksygenaasiaktiivisuuteen, sillä sekä itäminen että juurten kasvu ovat typpioksidin (NO) säätämiä. VHb:n on aikaisemmin todettu suojaavan kasvisoluja liiallisen NO-tuoton haitallisilta vaikutuksilta. Olosuhteissa, joissa NO toimii tärkeänä signaalimolekyylinä, kuten siemenen itämisessä ja juurten kasvussa, VHb voi kuitenkin hidastaa kasvua ja kehitystä. Työn toinen tavoite oli todentaa hypoteesi, jonka mukaan ohra kärsii hapen puutteesta mallastusprosessissa, ilmastuksesta huolimatta. Ilmastuksen vaikutusta alkion hapen puutteeseen tutkittiin mittaamalla indusoituvien ADH-entsyymien ADH2 ja ADH3 ilmestymstä, ADH-aktiivisuutta, etanolituottoa ja α-amylaasiaktiivisuutta. Lisäksi selvitettiin ohran mikrobiston vaikutus alkion hapen puutteeseen muokkaamalla mallastusprosessin mikrobipopulaatioita. Ilmastus tai mikrobien vähentäminen eivät lieventäneet alkion hapen puutetta. Bakteerien vähentäminen paransi hieman ohran itämistä, mutta vaikutusmekanismi ei liittynyt hapen puutteeseen. Monet mallastusprosessissa esiintyvät bakteerit tuottavat eksopolymeerisiä yhdisteitä, jotka saattavat inhiboida itämistä estämällä juuri-idun kasvua fyysisesti. Hapen puute näyttää olevan luonnollinen ja väistämätön vaihe ohran itämisessä. Muiden tutkimusryhmien tulokset ovat osoittaneet, että NO:ta muodostuu hapen puutteesta kärsivissä kasvisoluissa ja että NO stimuloi itämistä. Nämä tulokset yhdessä tämän tutkimuksen tulosten kanssa indikoivat, että alkion jonkin asteinen hapen puute saatta olla edullinen tai jopa välttämätön osa itämistä. Vaikka ilmastuksella ei ole mahdollista tai edes välttämätöntä lieventää ohran hapen puutetta, ilmastuksen tarve kasvaa mallastusprosessin edetessä. Ilmastus tuo itämisen loppuun viemiseen tarvittavan hapen ohralle, sekä poistaa jyvän myöhentymistä hidastavan hiilidioksidin ilmatilasta.Description
Keywords
alkaloid, barley, germination, haemoglobin, hairy root, hyoscyamine, Hordeum vulgare, Hyoscyamus muticus, malting, oxygen deficiency, VHb, Vitreoscilla
Other note
Parts
- Wilhelmson, A., Kallio, P.T., Oksman-Caldentey, K.-M. and Nuutila, A.M. 2005. Expression of Vitreoscilla hemoglobin enhances growth of Hyoscyamus muticus hairy root cultures. Planta Medica. Vol. 71. Pp. 48-53.
- Wilhelmson, A., Häkkinen, S.T., Kallio, P.T., Oksman-Caldentey, K.-M. and Nuutila, A.M. 2006. Heterologous expression of Vitreoscilla hemoglobin (VHb) and cultivation conditions affect the alkaloid profile of Hyoscyamus muticus hairy roots. Biotechnology Progress. Vol. 22. Pp. 350-358.
- Wilhelmson, A., Laitila, A., Vilpola, A., Olkku, J., Kotaviita, E., Fagerstedt, K. and Home, S. 2006. Oxygen deficiency in barley (Hordeum vulgare) grain during malting. Journal of Agricultural and Food Chemistry. Vol. 54. Pp. 409-416.
- Laitila, A., Kotaviita, E., Peltola, P., Home, S. and Wilhelmson, A. 2007. Indigenous microbial community of barley greatly influences grain germination and malt quality. Journal of the Institute of Brewing. Vol. 113. Pp. 9-20.
- Wilhelmson, A., Kallio, P.T., Oksman-Caldentey, K.-M. and Nuutila, A.M. 2007. Heterologous expression of Vitreoscilla haemoglobin in barley (Hordeum vulgare). Plant Cell Reports. Vol. 26. Pp. 1773-1783.
