Expression of in vivo phosphorylated recombinant silk-like proteins in Escherichia coli
No Thumbnail Available
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Kemian tekniikan korkeakoulu |
Master's thesis
Author
Date
2024-06-11
Department
Major/Subject
Biotechnology
Mcode
CHEM3022
Degree programme
Master's Programme in Chemical, Biochemical and Materials Engineering
Language
en
Pages
81
Series
Abstract
New materials are needed to replace plastics and other widely used materials with poor sustainability and biodegradability. Silk-like materials display a wide range of valued characteristics, including strong mechanical properties, biodegradability, and cytocompatibility and are thus potential candidates for the design of biomaterials. Post-translational modifications (PTMs), such as phosphorylations, have been observed in the natural silks. PTMs play a notable role in guiding the three-dimensional structure of the proteins and provide possible approaches for modifying silk material functionalities. Yet, their roles in artificial silks remain largely unexplored. One of the key reasons for this are technical challenges in the recombinant production of phosphorylated silk proteins. In this thesis, the aim was to produce phosphorylated silk proteins by co-expressing recombinant silk proteins and kinases in Escherichia coli. Three different silk proteins and four different kinases were tested for production and the ability to produce phosphorylated silk, correspondingly. Two of the silk proteins, spider dragline silk protein and insect silk protein, were expressed in soluble form. In addition, three of the four kinases were shown to phosphorylate silk proteins, as shown by phosphostaining, immunoblotting, and mass spectroscopy. The fusion of the target silk and kinase with SpyCatcher/SpyTag protein/peptide pair was used to successfully improve the specificity of the kinase to the substrate silk by increasing the local concentration via affinity. This also reduced the toxicity caused by the unspecific phosphorylation of the host cell proteins. Finally, by adjusting the expression conditions, silk proteins with different levels of phosphorylation could be produced. The results open new possibilities for studying PTMs and especially phosphorylations in silk-like proteins.Uusia materiaaleja tarvitaan korvaamaan muovit ja muut laajasti käytetyt materiaalit, joilla on heikko kestävyys ja biohajoavuus. Silkkiin perustuvilla materiaaleilla on monia erityispiirteitä, mukaan lukien mekaaniset ominaisuudet, hyvä biohajoavuus ja soluyhteensopivuus, jotka tekevät niistä potentiaalisia ehdokkaita biomateriaalien suunnitteluun. Translaation jälkeisiä muokkauksia, kuten fosforylaatioita, on havaittu luonnonsilkeissä. Nämä muokkaukset vaikuttavat proteiinien 3D-rakenteeseen, ja niiden avulla voi olla mahdollista muokata silkkimateriaalien toiminnallisia ominaisuuksia. Silti niiden tutkiminen keinotekoisissa silkeissä ei ole edennyt vielä pitkälle. Yksi tärkeimmistä syistä tähän ovat tekniset haasteet fosforyloidun silkin rekombinanttisessa tuottamisessa. Tämän diplomityön tavoitteena oli tuottaa fosforyloituja silkkiproteiineja rekombinantin silkin ja kinaasin yhteisekspressiolla Escherichia colissa. Työssä testattiin kolmen eri silkkiproteiinin ja neljän eri kinaasin tuottamista, ja vastaavasti kykyä fosforyloida silkkiä. Silkkiproteiineista kahta, hämähäkin vetosilkkiproteiinia ja hyönteisen silkkiproteiinia, pystyttiin tuottamaan liukoisessa muodossa. Lisäksi testatuista neljästä kinaasista kolmea voitiin käyttää silkkiproteiinien fosforyloimiseen, kuten fosfovärjäyksellä, immunoblottauksella ja massaspektrometrialla voitiin osoittaa. Kun kohdesilkkiin ja kinaasiin yhdistettiin proteiini/peptidipari SpyCatcher/SpyTag, kinaasin spesifisyyttä kohdesilkkiin saatiin onnistuneesti parannettua kasvattamalla paikallista konsentraatiota affiniteetilla. Tämä myös vähensi myrkyllisyyttä, joka johtui E. colin omien proteiinien epäspesifisestä fosforylaatiosta. Lopuksi, tuotettujen silkkiproteiinien fosforylaatiotasoon voitiin vaikuttaa muuttamalla ekspressio-olosuhteita. Työn tulokset avaavat uusia mahdollisuuksia translaation jälkeisten muokkausten ja erityisesti fosforylaatioiden tutkimiseen silkkiproteiineissa.Description
Supervisor
Linder, MarkusThesis advisor
Aranko, SesiljaFan, Ruxia
Keywords
recombinant silk, phosphorylation, kinase, SpyCatcher/SpyTag, phosphorylation level
