Recombinant silk like fusion proteins as next generation matrices for tissue engineering

Loading...
Thumbnail Image
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Kemian tekniikan korkeakoulu | Master's thesis
Date
2018-12-11
Department
Major/Subject
Biotechnology
Mcode
CHEM3022
Degree programme
Master's Programme in Chemical, Biochemical and Materials Engineering
Language
en
Pages
50+3
Series
Abstract
There is a growing need for tissue transplantations that cannot be met with current biomedical methods. Tissue engineering (TE) is a new interdisciplinary field that aims to construct viable tissues by utilizing artificial tissue scaffolds and bioreactors. To achieve this cells need to be provided with various stimuli that are present in their natural surroundings, the extracellular matrix (ECM). The most important properties of ECM are absence of cytotoxicity, biocompatibility, biodegradability and mechanical properties, which should be adapted in the scaffold biomaterial. Other necessary properties are zero risk of pathogens, versatile manufacturing and inexpensive production. Currently there is no such material available and thus TE is searching for new potential biomaterials, one of them being spider silk proteins. Spider silk proteins have exceptional mechanical properties, including no cytotoxic effects, biocompatibility and biodegradability. In addition, spider silks can be manufactured into different morphologies, such as fiber meshes or foams. However, cannibalistic nature of spiders and low production of silk protein make harvesting of native silk very inefficient. Recombinant production can be utilized to overcome these issues and previous research has shown that recombinant spider silk proteins are suitable for TE, and that the biocompatibility can be improved by introducing bioactive molecules to the protein structure via genetic engineering. Three silk like fusion proteins based on spidroin ADF3 by Araneus diadematus were produced with cytotoxic lipopolysaccharide free Escherichia coli strain. The silk constructs were CBM-ADF3-CBM, CBM-ADF3-FB_H-Crys and Crys-ADF3-FB_H-Crys, where CBM is cellulose binding module from Ruminiclostridium thermocellum, FB_H is heparin binding site from fibronectin and Crys is gamma crystallin D from Homo sapiens. Cytotoxicity and biocompatibility in forms of cell viability and adhesion were tested with human dermal fibroblast (HDF) cultivations on silk films, and the results showed notable improvement in cell viability when replacing CBM with Crys. In addition, there was no signs of cytotoxicity. Cell adhesion was hardly improved with addition of binding site in CBM-ADF3-FB_H-Crys suggesting inaccessibility of the site or non-compatibility with HDF. Results of Crys-ADF3-FB_H-Crys were comparable with conventional material gelatin.

Kudossiirrosten kysyntä kasvaa jatkuvasti eikä nykyiset lääketieteen menetelmät kykene vastaamaan tähän tarpeeseen. Kudosteknologia on uusi monitieteellinen ala, jonka tavoitteena on kasvattaa elinkelpoisia kudoksia käyttämällä keinotekoisia tukiverkkomateriaaleja ja bioreaktoreita. Tämän saavuttaakseen solut tarvitsevat samankaltaisia ärsykkeitä kuin niiden luonnollisessa elinympäristössä, soluväliaineessa. Väliaineen tärkeimmät ominaisuudet ovat biosopivuus, biohajoavuus, sytotoksisuus ja mekaaniset ominaisuudet, jotka tulisivat olla myös tukiverkko-materiaalissa. Lisäksi muita tarpeellisia ominaisuuksia ovat olematon patogeenien riski, tuotteen muotoilumenetelmät ja edullinen tuotanto. Tällä hetkellä vastaavaa materiaalia ei ole saatavilla, joten uusia lupaavia biomateriaaleja tutkitaan jatkuvasti, joista yksi on hämähäkin silkkiproteiini. Hämähäkin silkkiproteiineilla on erinomaiset mekaaniset ominaisuudet, ne eivät aiheuta sytotoksisuutta ja ovat biosopivia sekä biohajoavia. Lisäksi hämähäkin silkki voidaan valmistaa eri muotoihin, kuten kuituverkoksi ja vaahdoksi. Kuitenkin, hämähäkkien kannibalisminen luonne ja alhainen silkin tuotanto tekevät silkin keräyksestä erittäin epätehokasta. Rekombinanttituotantolla tuotto on skaalattavissa ja aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että rekombinantti hämähäkin silkki soveltuu kudosteknologian käyttötarpeisiin, ja että biosopivuutta voi parantaa lisäämällä bioaktiivisia molekyylejä silkkiproteiinin rakenteisiin geenitekniikan avulla. Tässä diplomityössä tuotettiin kolmea silkin kaltaista fuusioproteiinia, jotka pohjautuvat ADF3 silkkiproteiiniin (Araneus diadematus): CBM-ADF3-CBM, CBM-ADF3-FB_H-Crys ja Crys-ADF3-FB_H-Crys, jossa CBM on selluloosakiinnitysmoduuli (Ruminiclostridium thermo-cellum), FB_H on solukiinnityspaikka fibronektiinistä ja Crys on gamma D krystalliini (Homo sapiens). Tuotto tehtiin Escherichia coli kannalla (ClearColi BL21), joka ei tuota sytotoksisia lipopolysakkarideja. Silkin sytotoksisuus, solukiinnitys ja -elinkelpoisuus ominaisuudet testattiin ihokudossolukasvatuksilla (HDF) silkkiproteiinifilmeillä. Tulokset osoittivat huomattavan parannuksen soluelinkelpoisuudessa, kun CBM vaihdettiin krystalliiniksi. Sytotoksisia vaikutuksia ei huomattu. Solukiinnitys ei parantunut oletettavasti kiinnityspaikan lisäyksessä, mikä viittaa epäsopivuuteen HDF:n kanssa tai paikan luoksepääsemättömyyteen. Crys-ADF3-FB_H-Crys tulokset olivat verrattavissa yleisesti solukasvatuksissa käytettyyn gelatiiniin.
Description
Supervisor
Linder, Markus
Thesis advisor
Mohammadi, Pezhman
Keywords
tissue engineering, silk, spider, biocompatibility, fusion protein, recombinant
Citation