In vivo gene editing of Syndecan-1 in mice
Loading...
URL
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Kemian tekniikan korkeakoulu |
Master's thesis
Unless otherwise stated, all rights belong to the author. You may download, display and print this publication for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Authors
Date
2022-01-17
Department
Major/Subject
Biosystems and Biomaterials Engineering
Mcode
CHEM3028
Degree programme
Master’s Programme in Life Science Technologies
Language
en
Pages
82 + 12
Series
Abstract
Gene editing is a technology by which genomic DNA is modified at a specific location to change characteristics of a cell or an organism. There are many different methods for gene editing but nowadays so-called engineered nucleases are widely used to make targeted cuts to DNA. Most prominent editing technique at the moment is the CRISPR/Cas9 which is based on the bacterial CRISPR/Cas defence mechanism. Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease where the lipoproteinderived lipids accumulate in artery walls. Recent studies suggest that very low-density lipoproteins (VLDLs) may contribute to the process. Syndecan1 (SDC1) and N-deacetylase/N-sulfotransferase 1 (NDST1) are proteins that play a role in the clearance of triglyceride-rich VLDL particles from circulation – hence, their depletion could potentially increase VLDL concentration in plasma. The aim of this project was to investigate if it is possible to use CRISPR/Cas9 gene editing in vivo to acutely knock out hepatic expression of Sdc1 and Ndst1, encoding SDC1 and NDST1, in phenotypically normal mice and to investigate whether this increases circulating VLDL-levels. Custom recombinant adeno-associated viral vectors, that simultaneously encoded Cas9 and a guide-RNA targeting Sdc1 or Ndst1, were used. The vectors were first tested in vitro in cultured cells and were shown to reduce the expression of the targets. In vivo, the constructs induced hepatic expression of Cas9, and increased plasma VLDL and triacylglycerol, which was the expected physiological outcome of successful Sdc1/Ndst1 inactivation. However, molecular level evidence of successful editing of Sdc1 or Ndst1 was not obtained, rendering the outcome of the in vivo-experiment inconclusive.Geeni editointi on teknologia, jolla genomista DNA:ta muokataan spesifistä lokaatiosta aiheuttaen muutoksia solun tai organismin erityispiirteissä. Geeni editointia on mahdollista tehdä useilla eri metodeilla, mutta nykypäivänä niin kutsuttuja rekombinantteja fuusionukleaaseja (eng. engineered nucleases) käytetään laajasti, kun halutaan leikata DNA:ta kohdennetusti. Merkittävin geeni editointi tekniikoista on tällä hetkellä CRISPR/Cas9, joka pohjautuu bakteerien puolustusmekanismiin. Ateroskleroosi on kroonisen tulehduksen aiheuttama sairaus, jossa lipoproteiineista tulevat lipidit kertyvät valtimoiden seinämiin. Viime aikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että VLDL (eng. very low-density lipoprotein) mahdollisesti vaikuttaa kyseiseen prosessiin. Syndekaani-1 (SDC1) ja N-deasetylaasi/N-sulfotransferaasi 1 (NDST1) ovat proteiineja, jotka vaikuttavat triglyseriini rikkaiden VLDL partikkeleiden puhdistumaan verenkierrosta. Tämän takia niiden poistaminen mahdollisesti vaikuttaa VLDL konsentraation nousemiseen plasmassa. Tämän projektin tavoitteena oli tutkia mahdollisuutta käyttää CRISPR/Cas9 geeni editointia akuutisti in vivo poistamaan Sdc1 ja Ndst1 geeniekspressiota normaalin fenotyypin hiirten maksassa ja tutkimaan nostaako tämä kiertävän VLDL:n määrää veressä. Projektia varten suunniteltiin rekombinantit AAV-vektorit (eng. adenovirus associated vector), jotka koodaavat samanaikaisesti Cas9 proteiinia ja lähettiRNA:ta (mRNA) Sdc1 tai Ndst1 geenille. Vektoreita testattiin ensin in vitro kasvatetuilla soluilla ja nähtiin ekspression alentumista kohde geeneissä. In vivo, konstruktit indusoivat Cas9 geenin ekspressiota ja lisäsivät VLDL:n ja triasyyliglyserolin konsentraatiota plasmassa, mikä oli odotettu fysiologinen tulos onnistuneesta Sdc1/Ndst1 geenin inaktivaatiosta. Kuitenkin, molekyylitasolla merkkejä onnistuneesta Sdc1 tai Ndst1 geenin editoinnista ei nähty, minkä vuoksi in vivo kokeesta ei saatu vakuuttavaa tulosta.Description
Supervisor
Frey, AlexanderThesis advisor
Hermansson, MartinÖörni, Katariina
Keywords
gene editing, CRISPR/Cas9, Syndecan-1, mouse model