Developing an intracellular screening method for recombinant spider silk proteins

dc.contributorAalto-yliopistofi
dc.contributorAalto Universityen
dc.contributor.advisorGabryelczyk, Bartosz
dc.contributor.authorSammalisto, Fred-Eric
dc.contributor.schoolKemian tekniikan korkeakoulufi
dc.contributor.supervisorLinder, Markus
dc.date.accessioned2023-08-27T17:12:21Z
dc.date.available2023-08-27T17:12:21Z
dc.date.issued2023-08-21
dc.description.abstractBio-based materials are becoming increasingly important in our society to ensure a sustainable technological evolution. Nature has evolved a multitude of functional materials to fit different purposes. Spider silk is a natural protein-based fiber material outperforming any synthetic fossil-based fiber and has many attractive applications. Industrial use of spider silk, however, relies on recombinant protein technology, and to optimize the properties of the material requires knowledge about the natural molecular assembly and underlying mechanisms therein, such as liquid-liquid phase separation. To enable efficient de novo protein engineering, fast and high throughput screening methods for protein libraries consisting of many variants are essential. A library of rationally mutated variants of a previously characterized recombinant spider silk construct was used to investigate whether a previously developed screening method relying on probing intracellular spider silk coacervates using fluorescence and microscopy -based analytical techniques could be used to screen for spider silk variants with enhanced properties. The variants were assessed based on protein expression level, solubility and phase behaviour. The method was validated by comparing results obtained in this thesis with previously reported data. Then, a novel library of naturally occurring spider silk sequences was created to be screened with the method. Finally, to what degree the phase behaviour and viscosity of the silk protein affects fiber formation and mechanical performance was investigated. For this, selected variants were biomimetically spun into silk fibers using an approach that mimics the natural spinning process in spiders, and the spun fibers were mechanically tested. The screening method could successfully be applied on different libraries of spider silk proteins. Soluble variants could be identified in most cases by observing the appearance of intracellular coacervates with relatively high correlation with results from SDS-PAGE and FRAP analysis. Variants forming solid-like coacervates cannot be spun into fibers, however, no obvious correlation between the degree of coacervate liquid-likeness and spinnability or mechanical performance was found due to the limited amount of spinning data.en
dc.description.abstractBiobaserade material blir alltmer viktiga i vårt samhälle för att försäkra en hållbar teknologisk utveckling. Naturen har utvecklat ett flertal funktionella material för olika ändamål. Spindelsilke är ett naturligt proteinbaserat material som utmanar alla syntetiska fossilbaserade fibrer och har många attraktiva applikationer. Industriell användning av spindelsilke är dock beroende av rekombinant proteinteknologi, och för att optimera dess materialegenskaper krävs kunskap om dess naturliga molekylära sammansättning och underliggande mekanismer, t.ex. vätske-vätske-fasseparation. För att möjliggöra effektiv de novo proteinteknik behövs snabba screeningmetoder med hög kapacitet för proteinbibliotek bestående av flera varianter. Ett bibliotek av rationellt muterade varianter av ett från tidigare karakteriserat rekombinant spindelsilkesprotein användes för att undersöka huruvida en tidigare utvecklad screeningmetod som grundar sig i att undersöka intracellulära koacervat av spindelsilke m.h.a. fluorescens- och mikroskopibaserade analytiska metoder kunde användas för att screena spindelsilkesvarianter för förbättrade egenskaper. Varianterna bedömdes enligt proteinproduktionsnivå, löslighet och fasbeteende. Metoden validerades genom att jämföra resultaten från denna avhandling med tidigare publicerade data. Efter det gjordes ett nytt bibliotek av naturligt förekommande spindelsilkessekvenser för att screenas med metoden. Slutligen undersöktes till vilken grad silkesproteinets fasbeteende och viskositet påverkar fibrets sammanfogning och mekaniska prestation. För att göra detta valdes utvalda varianter för att biomimetiskt spinna fibrer med en metod som härmar spindlars naturliga spinningsprocess varefter fibrernas mekaniska egenskaper testades. Screeningmetoden kunde appliceras på olika bibliotek av spindelsilkesproteiner. Lösliga varianter kunde identifieras i de flesta fallen genom att observera intracellulära koacervats utseende med relativt hög korrelation med resultat från SDS-PAGE- och FRAP-analys. Varianter som bildar fasta koacervat kan inte bilda biomimetiska fibrer, men däremot hittades inget klart samband mellan graden av koacervatens vätskelikhet och förmågan att bilda fibrer eller mekanisk prestation p.g.a. bristfällig mängd data från fiberspinning och mekaniska tester.sv
dc.format.extent56+1
dc.identifier.urihttps://aaltodoc.aalto.fi/handle/123456789/122838
dc.identifier.urnURN:NBN:fi:aalto-202308275179
dc.language.isoenen
dc.locationPKfi
dc.programmeMaster’s Programme in Life Science Technologiesfi
dc.programme.majorBiosystems and Biomaterials Engineeringfi
dc.programme.mcodeCHEM3028fi
dc.subject.keywordspider silken
dc.subject.keywordrecombinant protein engineeringen
dc.subject.keywordliquid-liquid phase separationen
dc.subject.keywordprotein screeningen
dc.titleDeveloping an intracellular screening method for recombinant spider silk proteinsen
dc.titleUtvecklandet av en intracellulär screeningmetod för rekombinanta spindelsilkesproteinersv
dc.typeG2 Pro gradu, diplomityöfi
dc.type.ontasotMaster's thesisen
dc.type.ontasotDiplomityöfi
local.aalto.electroniconlyyes
local.aalto.openaccessno
Files