Demonstrating in silico validation analyses of qPCR assays using novel in-house software

No Thumbnail Available

URL

Journal Title

Journal ISSN

Volume Title

Perustieteiden korkeakoulu | Master's thesis

Date

2023-05-15

Department

Major/Subject

Bioinformatics and Digital Health

Mcode

SCI3092

Degree programme

Master’s Programme in Life Science Technologies

Language

en

Pages

76+10

Series

Abstract

The constant emergence of new pathogenic variants is driving the field of in vitro diagnostics to develop in silico procedures by witch the ensuant sequencing data can be exploited to maintain the desired test specificity and sensitivity without excessive laboratory screening. This work was commissioned by Mobidiag Ltd, a Hologic Inc company, as an independent project to analyse prototype qPCR assay designs by the screening of public sequence databases. The work demonstrates in silico procedures for quantitative validation of analytical specificity i.e. inclusivity and exclusivity of qPCR assays using two novel in-house software programs, and compares results for three multiplex qPCR test panel prototypes. The programs are at different stages of development and thus the performance and usability are further qualitatively assessed and compared. The results both substantiate the necessity of constant assay re-validations and reflect the target-dependency of the quality and quantity of available sequencing data; 22 \% of the 36 prototype assays evaluated were below 98 \% specific, while only three were found a concerning variant. The challenge of managing large amounts of data was illustrated by the number SARS-CoV2 sequences available. Furthermore, the arduousness of artificially rendering biological reaction systems hinders the development of fully automated programs that perform reliable analyses without human supervision.

Uusia patogeenisia mikrobivariantteja ilmaantuu jatkuvasti, mikä ajaa in-vitro diagnostiikan alaa kehittämään in-silico menetelmiä, joiden avulla nopeasti lisääntyvää sekvensointidataa voidaan hyödyntää testien spesifisyyden ja herkkyyden säilyttämiseksi ilman ylimääräistä laboratorioseulontaa. Tämä diplomityö tehtiin Mobidiag Ltd., a Hologic Inc. yritykselle itsenäisenä projektina, jossa analysoitiin prototyyppi qPCR -testipaneelien sisältämien alukkeiden kattavuutta uusien mikrobivarianttien varalta hyödyntämällä avoimia sekvenssitietokantoja. Työssä vertailtiin kahden sisäisen ohjelmiston mahdollistamia in-silico työnkulkuja kolmen eri multiplex qPCR-testipaneeli prototyypin sisältämien alukkeiden teoreettisten spesifisyyksien määrittämiseksi. Eri kehitysasteilla olevien ohjelmistojen tuloksia tarkasteltiin ja vertailtiin suorituskyvyn ja käytettävyyden lisäksi myös laadullisesti. Tulokset sekä tukevat testien jatkuvan uudelleenvalidoinnin tarpeellisuutta että heijastavat saatavilla olevan sekvensointidatan laadun ja määrän riippuvuutta kohdepatogeenista; 22 prosentilla 36:sta tarkastellusta patogeenista alukemallin inklusiivisuus jäi alle 98-prosenttiseksi, vaikka vain kolmen kohdalla tulos oli lopulta merkittävä. Suuren datan käsittelyyn liittyvät haasteet korostuivat SARS-CoV2-analyyseissä. Lisäksi tämän työn perusteella todetaan, että biologisten reaktiosysteemien monimutkaisuus vaikeuttaa sekä niiden keinotekoista mallintamista että niiden analysoimiseksi tarkoitettujen täysin automatisoitujen ohjelmien kehittämistä luotettaviksi.

Description

Supervisor

Rousu, Juho

Thesis advisor

Hokynar, Kati
Saharinen, Juha

Keywords

qPCR, in silico, inclusivity, pathogen detection

Other note

Citation