PIAS1-proteiinin tuotto Escherichia coli -bakteerissa ja bakuloviruksella infektoiduissa hyönteissoluissa

No Thumbnail Available

URL

Journal Title

Journal ISSN

Volume Title

Helsinki University of Technology | Diplomityö
Checking the digitized thesis and permission for publishing
Instructions for the author

Authors

Date

2003

Department

Kemian tekniikan osasto

Major/Subject

Bioprosessitekniikka

Mcode

Kem-70

Degree programme

Language

fi

Pages

viii + 50

Series

Abstract

PIAS (protein inhibitor of activated STAT) -proteiinit muodostavat vastikään löydetyn proteiiniperheen, jonka joillain jäsenillä on havaittu kyky inhiboida transkription aktivaatiota sytokiinivälitteisessä viestinnässä. Myöhemmin näiden proteiinien osoitettiin osallistuvan myös translaation jälkeiseen proteiinin muokkaustapahtumaan, sumolaatioon. PIAS proteiinit toimivat E3- ligaaseina monivaiheisen reaktioketjun viimeisessä osassa, jossa pieni ubikitiinia läheisesti muistuttava proteiini (SUMO) liitetään kohdeproteiinin lysiiniin kovalenttisellä sidoksella. Kohdeproteiinista riippuen sumolaation seuraukset voivat olla moninaiset. Sen on todettu vaikuttavan muun muassa proteiinin aktiivisuuteen, sijaintiin solussa ja vuorovaikutuksiin muiden proteiinien kanssa. Työn tarkoituksena oli optimoida olosuhteet kahden hiiren PIAS I proteiinin pienimuotoiselle tuotolle E. coli bakteerissa ja hyönteissoluissa. Tuotettavat proteiinit olivat villityyppi mPIAS1 ja sen mutantti mPIAS1delta310-407, jossa proteiinin rakenteesta on poistettu sinkkiä sitova alue (aminohapot 310-407). Hyönteissoluja käytettäessä geenin siirtovektorina toimi bakulovirus. Samalla haluttiin vertailla näissä systeemeissä tuotettujen proteiinien biologista aktiivisuutta sumolaatiossa in vitro. Proteiinin tuotto E. coli -bakteerissa osoittautui kannattamattomaksi varsin alhaisen saannon takia, ja tämän systeemin käytöstä luovuttiin. Syynä alhaiseen saantoon oli luultavasti proteiinin virheellinen laskostuminen ja siten kasautuminen liukenemattomiksi inclusion body rakenteiksi. Sen sijaan hyönteissoluissa proteiini ilmentyi liukoisessa muodossa. Proteiinin puhdistus suoritettiin affiniteettikromatografialla hyödyntäen proteiiniin liitettyä fuusiopeptidiä. Tämä puhdistusvaihe riitti poistamaan epäpuhtaudet niin, ettei jatkopuhdistusta tarvittu. Tuotetun proteiinin biologinen aktiivisuus varmistettiin sumolaatioreaktioissa in vitro. Tuotetun PIAS1proteiinin havaittiin aktivoivan substraatin (c-Jun) sumolaatiota kuten kirjallisuudessa on esitetty. Lisäksi PIAS1 proteiinin mutantti, josta puuttuu sinkkiä sitova alue, ei aktivoinut sumolaatiota. Tulokset vastaavat aikaisempaa käsitystä, että kyseinen rakennemotiivi on välttämätön edellytys PIAS proteiinien toimimiseksi sumolaation E3-ligaaseina.

Description

Supervisor

Leisola, Matti

Thesis advisor

Palvimo, Jorma

Keywords

Other note

Citation

Permanent link to this item

https://urn.fi/URN:NBN:fi:aalto-2020120449407

Collections

[dipl] Teknillinen korkeakoulu / TKK