Endotoxin Purification in Recombinant Protein Production using Escherichia coli

Abstract

The host organism Escherichia coli (E. coli) is preferred when producing recombinant proteins due to its quick growth, well-known genome and cost-effectiveness. A significant challenge associated with the host organism is the presence of lipopolysaccharides (LPS) also known as endotoxins. This potent pyrogen is an inherent part the outer membrane of gramnegative bacteria and trigger severe inflammatory responses in mammals. LPS consists of three parts: core oligosaccharide, Oantigen and lipid A. Lipid A is responsible for the inflammatory response in mammals. The two primary endotoxin detection methods are LAL-test (Limulus Amoebocyte Lysate) and rFC-test (recombinant Factor C). Two main types of purification strategies are reviewed: upstream and downstream. Upstream methods involve preventative measures to minimize endotoxin contamination during cultivation. Downstream methods involve purifying the protein solution after production has been completed.

The upstream method reviewed is the genetically modified E. colistrain KPM404, which produces non-toxic lipid IVA. Drawbacks of this method include regulatory challenges, as protein solution may yield false positive test results. Downstream methods reviewed include ion-exchange chromatography, affinity chromatography, ultrafiltration and Two-phase extraction with Triton X-114. Ion-exchange chromatography utilizes charge differences between LPS/protein and chromatographic medium. Its disadvantage is that it is ineffective against negatively charged proteins. Affinity chromatography utilizes highly selective polycationic ligands that capture endotoxins. This method struggles with LPS saturation and non-specific bonding of small proteins, requiring continuous washing which increases costs. Ultrafiltration is a size-based filtration method. This method is often used for concentrating protein preparations and is ineffective for solutions contain-ing LPS aggregates and small proteins. Two-phase extraction with Triton X-114 is based on temperature-induced phase separation. This method is effective for hydrophilic proteins but leaves behind detergent residue that require additional purification. This leads to protein loss.

The result of the comparison show that the effectiveness of each method is highly dependent on the physical and chemical properties of the protein. Thus, no single method is optimal. Advancements in protein engineering, genetically modified E. colistrains and endotoxin test methods are required for further progress in the industry.

Värdorganismen Escherichia coli (E. coli) föredras vid produktion av rekombinanta proteiner på grund av sin snabba tillväxt, välkända genom och kostnadseffektiva odlingsförhållanden. E. coli har dock en betydlig nackdel i sitt yttre membran: endotoxiner, som kallas även för lipopolysackarider (LPS). De är potenta pyrogener som inducerar allvarliga inflammatoriska reaktioner hos däggdjur. LPS frigörs vid proteinutvinning och kontaminerar proteinpreparationer. LPS består av tre delar: kärnoligosackarid, O-antigen och lipid A, varav lipid A är ansvarig för den inflammatoriska responsen. För att detektera endotoxiner i proteinpreparat används främst LAL-test (Limulus Amoebocyte Lysate) eller rFC-test (recombinant Factor C). Två huvudkategorier av reningsstrategier analyseras: uppströmsmetoder och nedströmsmetoder. Uppströmsmetoder innebär förebyggande åtgärder som minimerar endotoxiner under proteinproduktionsprocessen. Nedströmsmetoder innebär rening av proteinlösningen efter att produktionen har slutförts.

Uppströmsmetoden som granskas är den genetiskt modifierade E. colistammen KPM404, som producerar icke-toxiskt lipid IVA. Nackdelar med metoden inkluderar regulatoriska utmaningar, då proteinlösningen kan ge upphov till falska positiva testresultat. Nedströmsmetoder som granskas inkluderar jonbyteskromatografi, affinitetskromatografi, ultrafiltrering och tvåfasextraktion med Triton X-114. Jonbyteskromatografin utnyttjar laddningsskillnader mellan LPS/proteinet och kromatografibäraren. Nackdelen med metoden är dess ineffektivitet mot negativt laddade proteiner. Affinitetskromatografi använder sig av högt selektiva polykatjoniska l-gander som fångar endotoxiner. Metoden kämpar med LPS-mättnad och icke-specifik bindning av små proteiner, och kräver kontinuerlig rengöring vilket höjer kostnaderna. Ultrafiltrering är en storleksbaserad filtreringsmetod. Metoden används även för koncentrering av proteinpreparat, men är ineffektiv för lösningar med LPS-aggregat och mindre proteiner. Tvåfasextraktion med Triton X-114 bygger på temperaturinducerad fasseparering. Metoden är effektiv för hydrofila proteiner, men lämnar kvar detergentrester som kräver ytterligare rening vilket leder till proteinförlust.

Resultaten av jämförelsen visar att metodernas effektivitet påverkas starkt av proteinets fysikaliska och kemiska egenskaper, och därmed är ingen metod optimal. Utvecklingar inom proteinteknik, genetiskt modifierade E. colistammar och endotoxin-testmetoder krävs för ytterligare framsteg inom branschen.