Microbial production of xylitol, L-xylulose and L-xylose

Loading...
Thumbnail Image
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
School of Chemical Technology | Doctoral thesis (article-based) | Defence date: 2013-10-25
Checking the digitized thesis and permission for publishing
Instructions for the author
Date
2013
Major/Subject
Mcode
Degree programme
Language
en
Pages
98 + app. 44
Series
Aalto University publication series DOCTORAL DISSERTATIONS, 137/2013
Abstract
Rare sugars are defined as monosaccharides and their derivatives that are rare in nature. These rare sugars have many potential uses in medicine and food industry. Their derivatives can be used as antiviral and anticancer drugs. Most rare sugars taste sweet, but they are not metabolized by humans to the same level of more common sugars. Thus they can be used as low calorie sweeteners. Some rare sugars have the ability to suppress blood glucose and insulin levels and could thus be used as diabetes drugs. Also other medicinal and nutriceutical properties have been found. Rare sugars are generally expensive, as they cannot be isolated from natural sources in significant amounts. They are often produced by chemical means, but due to several steps and poor yields, the prices have stayed high. Biotechnological production is often superior to chemical methods once suitable enzymes acting on rare sugars are found. In this thesis the microbial production of two rare sugars – L-xylulose and L-xylose – and one sugar alcohol, xylitol, was studied. As a meso-sugar, xylitol is an intermediate between D- and L-sugars. It has several interesting characteristics, such as the ability to prevent dental caries and ear infections. In this thesis xylitol was produced from D-xylose by recombinant Lactococcus lactis harboring the xylose reductase gene from Pichia stipitis. The strain was able to produce xylitol from xylose in a quantitative yield, but it was not able to convert all the xylose initially present to xylitol. The productivity of the strain was competitive with previous reports using natural or recombinant strains. Next, the xylitol-4-dehydrogenase from Pantoea ananatis was produced recombinantly in Escherichia coli and characterized. The resting recombinant cells were used to produce L-xylulose from xylitol in quantitative yields. The volumetric productivity of this strain was one of the best reported to date. Last, the L-fucose isomerase gene from E. coli was overexpressed in a recombinant E. coli strain. The gene product was characterized and it was noticed to convert L-xylulose to L-xylose with the reaction balance strongly on the side of xylose. Contrary to earlier reports on the conversion between L-xylulose and L-xylose, practically no L-lyxose was formed with this enzyme. Resting cells of the recombinant strain were also able to convert L-xylulose to L-xylose. In conclusion, starting from a readily available sugar, D-xylose, xylitol and two rare sugars, L-xylulose and L-xylose were produced using resting cells of recombinant bacteria. Additionally, the enzymes performing the reaction between xylitol and L-xylulose, as well as between L-xylulose and L-xylose were characterized.

Luonnossa harvinaiset monosakkaridit ja niiden johdannaiset on määritelty harvinaisiksi sokereiksi. Harvinaisilla sokereilla on useita käyttömahdollisuuksia lääke- ja elintarviketeollisuudessa. L-Muotoisten sokereiden johdannaisia voidaan käyttää esimerkiksi virus- ja syöpälääkkeinä. Useimmat harvinaiset sokerit maistuvat makeilta, mutta sopivien entsyymien puutteessa ruoansulatus ei kykene käyttämään niitä kuten tavallisia sokereita. Tästä syystä harvinaisia sokereita voidaan käyttää vähäkalorisina makeutusaineina. Tietyillä harvinaisilla sokereilla on myös kyky alentaa veren sokeri- ja insuliinitasoja, mistä syystä niitä voitaisiin käyttää diabeteslääkkeinä. Koska harvinaisia sokereita ei voida eristää luonnosta merkittäviä määriä, ne ovat yleensä kalliita. Harvinaisia sokereita voidaan valmistaa kemiallisesti, mutta synteesit koostuvat yleensä useista vaiheista ja saannot ovat usein huonoja. Biotekniset tuotantomenetelmät ovat monesti osoittautuneet kemiallisia paremmiksi, kunhan löydetään sopivat entsyymit, joilla on aktiivisuutta haluttuja sokereita kohtaan. Tässä väitöskirjassa tutkittiin kahden harvinaisen sokerin – L-ksyluloosin ja L-ksyloosin – sekä sokerialkoholi ksylitolin mikrobiologista tuottoa. Ksylitoli on meso-sokeri, ja luonnollinen välimuoto muutettaessa D-sokereita L-sokereiksi. Lisäksi ksylitolilla on useita kiinnostavia ominaisuuksia, kuten kyky ehkäistä hammaskariesta ja korvatulehduksia. Tässä työssä ksylitolia tuotettiin D-ksyloosista Lactococcus lactis -bakteerilla, johon oli lisätty Pichia stipitis -hiivan ksyloosireduktaasi-geeni. Kyseinen kanta tuotti ksylitolia D-ksyloosista kvantitatiivisella saannolla, mutta se ei kyennyt käyttämään kaikkea lähtöainetta. Tuottonopeus oli kilpailukykyinen aiemmin raportoitujen tulosten kanssa. Seuraavaksi Pantoea ananatis -bakteerin ksylitoli-4-dehydrogenaasi-geeni kloonattiin Escherichia coli -bakteeriin ja sen tuottama entsyymi karakterisoitiin. Lepäävillä rekombinantti-soluilla saatiin tuotettua ksylitolista L-ksyluloosia kvantitatiivisella saannolla. Kannan tuottonopeus oli yksi parhaista tähän päivään mennessä raportoidusta. Lopulta E. coli -bakteerin L-fukoosi-isomeraasi-geeni yliekspressoitiin rekombinanttisessa E. coli -kannassa. Tuotettu entsyymi karakterisoitiin, ja sen todettiin isomeroivan L-ksyluloosia L-ksyloosiksi. Toisin kuin aiemmin raportoiduissa kokeissa, sivutuotteena ei syntynyt L-lyksoosia merkittäviä määriä. Lisäksi lepäävät solut tuottivat L-ksyloosia L-ksyluloosin toimiessa lähtöaineena. Yhteenvetona, tässä työssä valmistettiin ksylitolia, L-ksyluloosia ja L-ksyloosia lepäävillä rekombinanttisilla bakteerisoluilla. Lähtöaineena käytettiin halpaa D-ksyloosia. Lisäksi työssä karakterisoitiin entsyymit, jotka katalysoivat reaktioita ksylitolista L-ksyluloosiksi ja L-ksyluloosista L-ksyloosiksi.
Description
Supervising professor
Ojamo, Heikki, Prof., Aalto University, Department of Biotechnology and Chemical Technology, Finland
Thesis advisor
Nyyssölä, Antti, D.Sc. (Tech.), Technical Research Centre of Finland VTT, Finland
Keywords
xylitol, L-xylulose, L-xylose, rare sugars, metabolic engineering, ksylitoli, L-ksyluloosi, L-ksyloosi, harvinaiset sokerit, metabolian muokkaus
Other note
Parts
  • [Publication 1]: Nyyssölä, A., Pihlajaniemi, A., Palva, A., von Weymarn, N. and Leisola, M., Production of xylitol from D-xylose by recombinant Lactococcus lactis, J. Biotechnol. 118 (2005) 55-66.
  • [Publication 2]: Aarnikunnas, J.S., Pihlajaniemi, A., Palva, A., Leisola, M. and Nyyssölä, A., Cloning and expression of a xylitol-4-dehydrogenase gene from Pantoea ananatis, Appl. Environ. Microbiol. 72 (2006) 368-377.
  • [Publication 3]: Usvalampi, A., Kiviharju, K., Leisola, M. and Nyyssölä, A., Factors affecting the production of L-xylulose by resting cells of recombinant Escherichia coli, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 36 (2009) 1323-1330.
  • [Publication 4]: Usvalampi, A., Turunen, O., Valjakka, J., Pastinen, O., Leisola, M. and Nyyssölä, A., Production of L-xylose from L-xylulose using Escherichia coli L-fucose isomerase, Enzyme Microb. Tech. 50 (2012) 71-76.
Citation