Towards a process scale purification method for mouse monoclonal immunoglobulin M

No Thumbnail Available
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Kemian tekniikan korkeakoulu | Master's thesis
Ask about the availability of the thesis by sending email to the Aalto University Learning Centre oppimiskeskus@aalto.fi
Date
2015-05-12
Department
Major/Subject
Biotekniikka ja elintarviketekniikka
Mcode
KE3002
Degree programme
KEM - Kemian tekniikan koulutusohjelma
Language
en
Pages
71
Series
Abstract
During the last decades monoclonal antibodies have become important tools in a vast range of therapeutic and diagnostic applications. Most of these applications require substantially pure antibodies. While monoclonal antibodies of the G class can be conveniently purified by affinity chromatography using immobilized protein A or G, even on a large scale, the scale up of immunoglobulin M purification still presents several problems, since specific and cost-effective ligands for IgM are not available. The objective of this thesis was to develop a purification protocol for mouse monoclonal IgM with potential for scaling up. The intended use of the purified IgM was a virus recognizing component of a rapid test for detection of influenza B. In the literature part, the special features of IgM and potential purification protocols including precipitation and chromatographic methods were reviewed. The chosen purification methods for experimental part were precipitation using PEG 6000 and ion exchange chromatography focusing on weak anion exchange with DEAE-FF matrix. Different PEG-concentrations were tested and pH was optimized for the anion exchange in order to ameliorate the IgM recovery and purity. IgM activity at different pHs was also screened. The success of the purification was controlled by measuring the total protein amount of the purified samples and the IgM concentration by fluorescence immunoassay. The possible changes of IgM activity were also controlled. The best IgM recovery (98%) was obtained by precipitation with 10% (w/v) PEG. However, the PEG precipitation increased the purity only to 6.3% from the starting point of 2%. The anion exchange chromatography using Hi-Trap DEAE-FF column raised the purity to 90% with recovery of 15%. These rather low results indicate that more research is still needed before the purification protocol meets the criteria of industrial scale purification.

Viimeisten vuosikymmenten aikana monoklonaalisista vasta-aineista on tullut osa arkipäivää monissa terapeuttisissa valmisteissa sekä diagnostisissa sovelluksissa. Monissa näistä sovelluksista vaatimuksena on, että käytetty vasta-aine on erittäin puhdas. Immunoglobuliini G -luokan vasta-aineille on olemassa teollisuusmittakaavassakin käytössä oleva affiniteettikromatografinen puhdistusmenetelmä (immobilisoitu proteiini A/G), mutta immunoglobuliini M:lle varmaa teollisuusmittakaavaista menetelmää ei ole vielä onnistuttu kehittämään. Tämän diplomityön tavoitteena oli kehittää monoklonaaliselle hiiren IgM:lle puhdistusmenetelmä, jota olisi myös mahdollista soveltaa teollisessa mittakaavassa. Puhdistetun IgM:n käyttötarkoituksena on toimiminen viruksen tunnistavana komponenttina influenssa B -pikatestissä. Työn kirjallisuuskatsauksessa tarkasteltiin sekä IgM:n erityisominaisuuksia että mahdollisia puhdistusmenetelmiä ja niiden soveltuvuutta käytettäväksi teollisessa mittakaavassa. Näitä olivat muun muassa erilaiset saostusmenetelmät sekä ioninvaihtokromatografia. Tutkittaviksi menetelmiksi kokeellista osaa varten valikoituivat polyetyleeniglykoli-saostus (PEG 6000) sekä ioninvaihtokromatografia keskittyen heikkoon anioninvaihtokromatografiaan hyödyntäen DEAE-FF -materiaalia. PEG-saostuksessa etsittiin tarvittava PEG-konsentraatio ja anioninvaihtokromatografiaa varten määritettiin pH, joilla IgM:n saanto ja puhtaus olivat mahdollisimman korkeat. Lisäksii IgM:n aktiivisuus pH-välillä 2–10 kartoitettiin. Puhdistuksen onnistumista tarkkailtiin mittaamalla näytteiden kokonaisproteiinimäärää sekä IgM:n konsentraatiota FIA-immunomäärityksellä. Tämän lisäksi seurattiin mahdollisia muutoksia IgM:n aktiivisuudessa. Suurin IgM-saanto (98 %) saavutettiin saostamalla IgM-liuosta käyttäen 10 % (w/v) polyetyleeniglykolia. Saostuksen myötä IgM:n puhtaus kohosi kuitenkin vain alun 2 %:sta 6,3 %:iin. Anioninvaihdon jälkeen IgM:n puhtaus nousi 90 %, mutta tällöin saanto puolestaan oli vain 15 %. Teollisuuden tarpeisiin sekä puhtaus että saanto ovat liian matalia, joten puhdistusprosessi
Description
Supervisor
Frey, Alexander
Thesis advisor
Koskela, Essi
Höyhtyä, Matti
Keywords
immunoglobulin M, PEG-precipitation, anion exchange chromatography, antibody purification
Other note
Citation