Expression of recombinant proteins in Lactococcus lactis – an application in D-tagatose production

Loading...
Thumbnail Image
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
School of Chemical Technology | Doctoral thesis (article-based) | Defence date: 2023-12-08
Date
2023
Major/Subject
Mcode
Degree programme
Language
en
Pages
87 + app. 49
Series
Aalto University publication series DOCTORAL THESES, 197/2023
Abstract
Lactococcus lactis is a commercially attractive host for recombinant protein production with many potential applications, for example, in the food and pharmaceutical industries. Production of recombinant proteins requires a suitable expression system, and the aim of this study was to develop new inducible recombinant protein expression systems for L. lactis. In addition, a special application for a developed expression system in D-tagatose production was investigated. D-Tagatose is a functional low-calorie sweetener, but the production costs still limit its use. Two new protein expression systems were developed, of which the first was based on a phosphate starvation-inducible pstF promoter of L. lactis MG1363. High expression levels of intracellular β-galactosidase (670 µkat g-1) and secreted α-amylase (3.6 μkat l-1) were achieved using this strictly regulated expression system. The other new protein expression system was based on the salt-inducible BusA promoter and the BusR repressor gene of L. lactis MG1363. To achieve salt-inducible protein expression, the BusR expression was adjusted by generating random mutations to its promoter area. In the bioreactor, a 6.0 μkat l-1 α-amylase activity was reached, however, without strict regulation. Inducing agents were not needed with either expression system in the bioreactor. Due to strict regulation and high expression levels, the phosphate starvation-inducible expression system was chosen to overexpress Bifidobacterium longum L-arabinose isomerase. The purified enzyme was characterized, and it turned out to be active and stable at acidic pH (optimum 6.0-6.5), and optimally active at 55 °C. The Km values were 120 mM and 590 mM, and Vmax values were 42 U mg-1 and 7.7 U mg-1, for L-arabinose and D-galactose, respectively. The enzyme bound the metal cofactors (Mg2+, Ca2+) tightly, but the metal ion requirement was low for catalytic activity. Divalent metal ions, preferably Mg2+, were required for enzyme stability at higher temperatures. Because of the promising characteristics of the enzyme and high expression level, the use of resting L. lactis cells harboring B. longum L-arabinose isomerase to produce D-tagatose was investigated. Optimization analysis showed high pH, temperature, and borate concentration favored D-tagatose production. Almost quantitative conversion (92 %) was reached in a borate buffer after five days (20 g l-1 D-galactose, 37.5 °C). D-Tagatose production was also investigated with high substrate concentration (300 g l-1 D-galactose, 1.15 M borate, 41 °C) in a 10-day batch process, changing the production medium every 24 h. A D-tagatose production rate of 185 g l-1 day-1 was achieved, comparable with reported numbers in the literature. The results indicated that the use of resting cells stabilized the enzyme. There was no loss in productivity during the ten sequential batches. To further develop the D-tagatose production process, the cells could be immobilized in a packed-bed bioreactor to enable continuous production. Developing the new expression systems to be food-grade could enable more applications.

Lactococcus lactis on kaupallisesti houkutteleva isäntä rekombinanttiproteiinien tuotantoon ja sillä on monia mahdollisia sovelluksia esim. elintarvike- ja lääketeollisuudessa. Rekombinanttiproteiinien tuotanto vaatii sopivan tuottosysteemin, ja tämän tutkimuksen tavoitteena oli kehittää uusia indusoituvia tuottosysteemejä L. lactis -bakteerille. Lisäksi tutkittiin kehitetyn tuottosysteemin soveltuvuutta D-tagatoosin tuotantoon. D-Tagatoosi on vähäkalorinen makeutusaine, jolla on monia terveyshyötyjä, mutta tuotantokustannukset rajoittavat yhä sen käyttöä. Työssä kehitettiin kaksi uutta proteiinintuottosysteemiä, joista ensimmäinen perustui L. lactis MG1363:n pstF-promoottoriin. Käyttämällä tätä tiukasti säädeltyä fosfaatin puutoksesta indusoituvaa tuottosysteemiä saavutettiin korkeat solunsisäisen β-galaktosidaasin (670 µkat g-1) ja erittyvän α-amylaasin (3,6 µkat l-1) tuottotasot. Toinen proteiinintuottosysteemi perustui L. lactis MG1363:n suolaindusoituvaan BusA promoottoriin ja BusR säätelygeeniin. Suolaindusoituvan tuottosysteemin aikaansaamiseksi BusR geenin tuottotasoa säädettiin mutatoimalla sen promoottorialuetta. Tällä tuottosysteemillä saavutettiin bioreaktorissa 6,0 μkat l-1 α-amylaasiaktiivisuus, mutta ilman tiukkaa säätelyä. Indusoivia aineita ei tarvittu bioreaktorissa kummallakaan tuottosysteemillä. Tiukan säätelyn ja korkeiden tuottotasojen vuoksi fosfaatinpuutoksesta indusoituva tuottosysteemi valittiin Bifidobacterium longum L-arabinoosi-isomeraasin tuottoon. Puhdistettu entsyymi karakterisoitiin, ja se osoittautui aktiiviseksi ja stabiiliksi happamassa pH:ssa (optimi 6,0–6,5) ja optimaalisesti aktiiviseksi 55 °C:ssa. Km-arvot olivat 120 mM ja 590 mM ja Vmax-arvot olivat 42 U mg-1 ja 7,7 U mg-1, L-arabinoosille ja D-galaktoosille. Entsyymi sitoi metallikofaktorit (Mg2+, Ca2+) tiukasti, mutta sen metallintarve katalyyttistä aktiivisuutta varten oli alhainen. Metalli-ioneja, erityisesti Mg2+, tarvittiin kuitenkin stabiilisuuteen korkeissa lämpötiloissa. Entsyymin lupaavista ominaisuuksista ja korkeasta tuottotasosta johtuen tutkittiin L-arabinoosi isomeraasia sisältävien L. lactis -solujen käyttöä D-tagatoosin tuottoon. Optimointikoe osoitti, että korkea pH, lämpötila ja boraattipitoisuus suosivat tuottoa. Boraattipuskurissa saavutettiin lähes kvantitatiivinen (92 %) konversio viiden päivän kuluessa (20 g l-1 D-galaktoosi, 37,5 °C). D-Tagatoosin tuottoa tutkittiin myös 10 päivän prosessissa (300 g l-1 D-galaktoosi, 1.15 M boraatti, 41 °C), jossa alusta vaihdettiin uuteen kerran vuorokaudessa. Näin saatiin D-tagatoosin tuottotasoksi 185 g l-1 vrk-1, mikä vertautuu kirjallisuudessa raportoituihin lukuihin. Lepäävien solujen käytöllä oli stabiloiva vaikutus entsyymiin, sillä tuottavuus ei heikentynyt 10 peräkkäisen panoksen aikana. Tuotantoprosessin kehittämiseksi jatkuvatoimiseksi solut voitaisiin vielä immobilisoida pakattuun bioreaktoriin. Uusien tuottosysteemien kehittäminen elintarvikelaatuisiksi voisi mahdollistaa lisää sovelluksia.
Description
Supervising professor
Frey, Alexander, Prof., Aalto University, Department of Bioproducts and Biosystems, Finland
Thesis advisor
Nyyssölä, Antti, D. Sc. (Tech.), VTT Technical Research Centre of Finland, Finland
Keywords
lactococcus lactis, recombinant protein expression, D-tagatose, bifidobacterium longum, L-arabinose isomerase, lactococcus lactis, rekombinattiproteiinien tuotto, D-tagatoosi, bifidobacterium longum, L-arabinoosi-isomeraasi
Other note
Parts
  • [Publication 1]: Sirén, N., Salonen, K., Leisola, M., Nyyssölä, A., A new efficient phosphate starvation inducible expression system for Lactococcus lactis, Appl. Microbiol. Biotechnol. 79 (2008) 803-810.
    Full text in Acris/Aaltodoc: http://dx.doi.org/10.1007/s00253-008-1484-4
    DOI: 10.1007/s00253-008-1484-4 View at publisher
  • [Publication 2]: Sirén, N., Salonen, K., Leisola, M., Nyyssölä, A., A new salt inducible expression system for Lactococcus lactis, Biochem. Eng. J. 48 (2009) 132-135.
    Full text in Acris/Aaltodoc: http://dx.doi.org/10.1016/j.bej.2009.08.003
    DOI: 10.1016/j.bej.2009.08.003 View at publisher
  • [Publication 3]: Salonen, N., Nyyssölä, A., Salonen, K., Turunen, O., Bifidobacterium longum L-arabinose isomerase – overexpression in Lactococcus lactis, purification and characterization, Appl. Biochem. Biotechnol. 168 (2012) 392-405.
    DOI: 10.1007/s12010-012-9783-8 View at publisher
  • [Publication 4]: Salonen, N., Salonen, K., Leisola, M., Nyyssölä, A., D-Tagatose production in the presence of borate by resting Lactococcus lactis cells harboring Bifidobacterium longum L-arabinose isomerase, Bioprocess. Biosyst. Eng. 36 (2013) 489-497.
    Full text in Acris/Aaltodoc: http://dx.doi.org/10.1007/s00449-012-0805-2
    DOI: 10.1007/s00449-012-0805-2 View at publisher
Citation