Trichoderma reesein sellobiohydrolaasi I:n ja II:n sitoutuminen selluloosaan; tritiumilla leimattujen proteiinien käyttö
No Thumbnail Available
URL
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Helsinki University of Technology |
Diplomityö
Checking the digitized thesis and permission for publishing
Instructions for the author
Instructions for the author
Authors
Date
1998
Department
Major/Subject
Biokemia
Mcode
Kem-30
Degree programme
Language
fi
Pages
viii + 79
Series
Abstract
Työssä selvitettiin Trichoderma reesein sellobiohydrolaasi I:n ja II:n sekä niiden yksittäisten osien, katalyyttisen osan ja selluloosaan sitoutuvan osan (CBD) sitoutumista kiteiseen bakteeriselluloosaan. Proteiinit leimattiin in vitro [3]H:lla. Radioaktiivisen leiman avulla pystyttiin mittaamaan tarkasti alhaisia proteiinin konsentraatiota nestefaasissa. Leimaus suoritettiin pelkistävällä metylaatiolla, jolloin tritiumatomeja sisältävät metyyliryhmät kiinnittyivät proteiinin vapaisiin aminoryhmiin. Leimatut preparaatit puhdistettiin geelisuodatuksella ja puhtaus tarkistettiin ioninvaihtokromatografialla. Metyloitujen entsyymien katalyyttinen aktiivisuus ja sitoutumiskyky säilyivät muuttumattomina. Sitoutuminen oli lämpötilasta riippuvaista. Määritetyistä sitoutumisisotermeistä ilmeni, että alhaisissa lämpötiloissa proteiinit sitoutuivat selvästi paremmin selluloosaan. Lisäksi todettiin, että kokonaiset entsyymit sitoutuivat paremmin kuin niiden osat. Katalyyttiset osat sitoutuivat heikoimmin. CBH I:n sitoutuminen oli reversiibeliä ja se voitiin irrottaa bakteeriselluloosasta puskurinlisäyksellä. Laimennoksen jälkeen eri ajanhetkinä tehdyt mittaukset osoittivat, että uusi tasapainotila muodostui samalle isotermille. CBH II:n sitoutuminen oli osittain reversiibeliä. Sellobioosi lisäsi molempien entsyymien katalyyttisten osien sitoutumista, mutta kokonaisen CBH II:n adsorptio väheni. Selluloosan hydrolyysin edetessä entsyymien sitoutuminen jäljellä olevaa substraattia kohtaan muuttui yllättävästi. Hydrolyysin alkuvaiheessa sitoutuminen noudatti sitoutumisisotermin tasapainoa, mutta kun noin puolet näytteen selluloosasta oli hajonnut, sitoutuneen entsyymin määrä jäljellä olevaa selluloosaa kohti kasvoi 2 - 3 -kertaiseksi. Työn kirjallisuusosassa käsiteltiin proteiinien kemiallista leimausta in vitro. Proteiinien muokattavissa olevat aminohappojen sivuketjut sekä niihin kohdistuvat tärkeimmät kemialliset reaktiot esiteltiin. Tärkeimpiä leimaustekniikoita eli fluoresenssileimoja, proteiinien biotinylaatiota ja radioisotooppileimausta tarkasteltiin laajemmin.Description
Supervisor
Laakso, SimoThesis advisor
Linder, MarkusTenkanen, Maija