Production and functional characterization of novel expansin-like proteins from eukaryotic sources
Loading...
URL
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Kemian tekniikan korkeakoulu |
Master's thesis
Unless otherwise stated, all rights belong to the author. You may download, display and print this publication for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Authors
Date
2022-06-14
Department
Major/Subject
Biotechnology
Mcode
CHEM3022
Degree programme
Master's Programme in Chemical, Biochemical and Materials Engineering
Language
en
Pages
46 + 8
Series
Abstract
Lignocellulosic plant biomass is a renewable and abundant resource of fermentable sugars for biotechnological processes. However, pretreatment of plant biomass remains challenging due to its complex structure comprising mainly cellulose, hemicellulose, and lignin. Among the conventional pretreatment approaches (mechanical, chemical, biological), biological treatment using hydrolytic enzymes is preferred as green technology. The drawback is that the structure of lignocellulose is densely-packed, resulting in poor accessibility of binding sites for the hydrolytic and oxidative enzymes. Expansins are plant proteins that open up the structure of lignocellulose, enhancing the accessibility of the substrate to degrative enzymes, and therefore improving the enzymatic pretreatment of lignocellulose. However, the recombinant production of plant expansins has proven to be problematic, resulting in inactive forms of the proteins. Nevertheless, expansin-like proteins (EXLX) with similar functionalities to plant expansins are also found in diverse microorganisms. Although plant expansins and EXLXs share only low sequence similarity, the structural resemblance is distinct. Bacterial EXLXs are successfully produced in Escherichia coli, but the expression of eukaryotic EXLXs is a less studied approach. The objective of this study was to discover novel EXLXs from eukaryotic sources. Five target genes were expressed in Pichia pastoris, resulting in high expression levels of two novel proteins. These two proteins were produced in shake-flask cultivations and purified using affinity chromatography. Functional characterization was performed using pull-down binding assays and synergy activity measurements and by visualizing the EXLX-induced microstructural changes in defibrillated hardwood pulp. A strong binding affinity towards oat spelt xylan was observed within both characterized proteins. As a result, several experiments to assess synergy between these novel EXLXs and xylanase were conducted. Although it was observed that xylanase and substrate concentration had an impact on the synergy assessment, the reaction conditions need to be furtherly optimized. However, a typical characteristic of EXLXs was observed in microstructural changes of dried hardwood pulp, as demonstrated in this thesis, illustrated by scanning electron microscopy (SEM).Lignoselluloosa pohjainen biomassa on hyvin saatavilla oleva uusiutuva luonnonvara, joka sopii raaka-aineeksi bioteknologisiin prosesseihin. Biomassa koostuu pääasiassa selluloosasta, hemiselluloolasta ja ligniinistä, jotka muodostavat lignoselluloosan kompleksisen rakenteen. Tämä monitahoisuus tekee biomassan esikättelystä ja hajottamisesta fermentoitaviksi sokereiksi hankalaa. Tavanomaisimmista käsittelytavoista (mekaaninen, kemiallinen, biologinen), suositaan vihreän teknologian mukaista biologista esikäsittelyä, jossa hyödynnetään hydrolyyttisiä entsyymejä. Lignoselluloosan tiukasti pakattu rakenne kuitenkin vaikeuttaa entsyymien kiinnittymistä sen eri komponentteihin. Ekspansiinit ovat kasviproteiineja, jotka avaavat lignoselluloosan rakennetta, ja siten edistävät hajottavien entsyymien kiinnittymistä substraattiin, mikä omalta osaltaan parantaa lignoselluloosan entsymaattista käsittelyä. Kasviperäisten expansiinien tuottaminen geenitekniikan keinoin on kuitenkin vaikeaa. Ekspansiinien kaltaisia proteiineja (engl. expansin-like protein, EXLX) tuottaa luonnossa useat eri mikrobit. Vaikka kasviperäisten ja mikrobisten ekspansiinien aminohapposekvenssit eroavat suurelta osin toisistaan, niiden rakenteellinen yhdenmukaisuus on selvästi havaittavissa. Mikrobisista ekspansiineistä prokaryoottisia ekspansiinejä on tuotettu onnistuneesti Escherichia coli -bakteerissa, mutta eukaryoottisten ekspansiinien tuottoa on tutkittu vähemmän. Tämän diplomityön tavoitteena oli löytää uusia eukaryoottisia EXLX-proteiineja. Viiden tavoitegeenin ekspressio Pichia pastoris -hiivassa johti kahden korkeimman ekspressiotason saavuttaneen proteiinin tuottoon pullokasvatuksessa ja puhdistukseen hyödyntäen affiniteettikromatografiaa. Toiminnallisessa karakterisoinnissa analysoitiin proteiinien sitoutumista eri substraatteihin, sekä tutkittiin proteiinien synergistä vaikutusta puumassan (engl. hardwood pulp) hydrolysointiin ja arvioitiin proteiinien aiheuttamia muutoksia puukuitujen rakenteeseen. Molemmat proteiinit sitoutuivat voimakkaasti ksylaaniin (kaurasta), mistä johtuen EXLX-proteiinien vaikutusta puumassan hydrolysointiin tutkittiin yhdessä ksylanaasin kanssa. Tutkimuksessa havaittiin, että ksylanaasin ja puumassan konsentraatio vaikuttivat synergisen toiminnan mittaamiseen, ja lisätutkimuksia tarvitaan reaktio-olosuhteiden optimoimiseksi. Molemmat karakterisoidut proteiinit kuitenkin osoittivat EXLX-proteiineille tyypillistä kykyä aiheuttaa muutoksia puumassan mikrorakenteeseen, mikä on tässä työssä havainnollistettu pyyhkäisyelektronimikroskoopilla.Description
Supervisor
Master, EmmaThesis advisor
Haddad Momeni, MajidKeywords
microbial expansin-like proteins, gene expression, protein purification, enzyme synergy, Pichia pastoris, lignocellulose degradation