Production and functional characterization of novel expansin-like proteins from eukaryotic sources

Loading...
Thumbnail Image

URL

Journal Title

Journal ISSN

Volume Title

Kemian tekniikan korkeakoulu | Master's thesis

Date

2022-06-14

Department

Major/Subject

Biotechnology

Mcode

CHEM3022

Degree programme

Master's Programme in Chemical, Biochemical and Materials Engineering

Language

en

Pages

46 + 8

Series

Abstract

Lignocellulosic plant biomass is a renewable and abundant resource of fermentable sugars for biotechnological processes. However, pretreatment of plant biomass remains challenging due to its complex structure comprising mainly cellulose, hemicellulose, and lignin. Among the conventional pretreatment approaches (mechanical, chemical, biological), biological treatment using hydrolytic enzymes is preferred as green technology. The drawback is that the structure of lignocellulose is densely-packed, resulting in poor accessibility of binding sites for the hydrolytic and oxidative enzymes. Expansins are plant proteins that open up the structure of lignocellulose, enhancing the accessibility of the substrate to degrative enzymes, and therefore improving the enzymatic pretreatment of lignocellulose. However, the recombinant production of plant expansins has proven to be problematic, resulting in inactive forms of the proteins. Nevertheless, expansin-like proteins (EXLX) with similar functionalities to plant expansins are also found in diverse microorganisms. Although plant expansins and EXLXs share only low sequence similarity, the structural resemblance is distinct. Bacterial EXLXs are successfully produced in Escherichia coli, but the expression of eukaryotic EXLXs is a less studied approach. The objective of this study was to discover novel EXLXs from eukaryotic sources. Five target genes were expressed in Pichia pastoris, resulting in high expression levels of two novel proteins. These two proteins were produced in shake-flask cultivations and purified using affinity chromatography. Functional characterization was performed using pull-down binding assays and synergy activity measurements and by visualizing the EXLX-induced microstructural changes in defibrillated hardwood pulp. A strong binding affinity towards oat spelt xylan was observed within both characterized proteins. As a result, several experiments to assess synergy between these novel EXLXs and xylanase were conducted. Although it was observed that xylanase and substrate concentration had an impact on the synergy assessment, the reaction conditions need to be furtherly optimized. However, a typical characteristic of EXLXs was observed in microstructural changes of dried hardwood pulp, as demonstrated in this thesis, illustrated by scanning electron microscopy (SEM).

Lignoselluloosa pohjainen biomassa on hyvin saatavilla oleva uusiutuva luonnonvara, joka sopii raaka-aineeksi bioteknologisiin prosesseihin. Biomassa koostuu pääasiassa selluloosasta, hemiselluloolasta ja ligniinistä, jotka muodostavat lignoselluloosan kompleksisen rakenteen. Tämä monitahoisuus tekee biomassan esikättelystä ja hajottamisesta fermentoitaviksi sokereiksi hankalaa. Tavanomaisimmista käsittelytavoista (mekaaninen, kemiallinen, biologinen), suositaan vihreän teknologian mukaista biologista esikäsittelyä, jossa hyödynnetään hydrolyyttisiä entsyymejä. Lignoselluloosan tiukasti pakattu rakenne kuitenkin vaikeuttaa entsyymien kiinnittymistä sen eri komponentteihin. Ekspansiinit ovat kasviproteiineja, jotka avaavat lignoselluloosan rakennetta, ja siten edistävät hajottavien entsyymien kiinnittymistä substraattiin, mikä omalta osaltaan parantaa lignoselluloosan entsymaattista käsittelyä. Kasviperäisten expansiinien tuottaminen geenitekniikan keinoin on kuitenkin vaikeaa. Ekspansiinien kaltaisia proteiineja (engl. expansin-like protein, EXLX) tuottaa luonnossa useat eri mikrobit. Vaikka kasviperäisten ja mikrobisten ekspansiinien aminohapposekvenssit eroavat suurelta osin toisistaan, niiden rakenteellinen yhdenmukaisuus on selvästi havaittavissa. Mikrobisista ekspansiineistä prokaryoottisia ekspansiinejä on tuotettu onnistuneesti Escherichia coli -bakteerissa, mutta eukaryoottisten ekspansiinien tuottoa on tutkittu vähemmän. Tämän diplomityön tavoitteena oli löytää uusia eukaryoottisia EXLX-proteiineja. Viiden tavoitegeenin ekspressio Pichia pastoris -hiivassa johti kahden korkeimman ekspressiotason saavuttaneen proteiinin tuottoon pullokasvatuksessa ja puhdistukseen hyödyntäen affiniteettikromatografiaa. Toiminnallisessa karakterisoinnissa analysoitiin proteiinien sitoutumista eri substraatteihin, sekä tutkittiin proteiinien synergistä vaikutusta puumassan (engl. hardwood pulp) hydrolysointiin ja arvioitiin proteiinien aiheuttamia muutoksia puukuitujen rakenteeseen. Molemmat proteiinit sitoutuivat voimakkaasti ksylaaniin (kaurasta), mistä johtuen EXLX-proteiinien vaikutusta puumassan hydrolysointiin tutkittiin yhdessä ksylanaasin kanssa. Tutkimuksessa havaittiin, että ksylanaasin ja puumassan konsentraatio vaikuttivat synergisen toiminnan mittaamiseen, ja lisätutkimuksia tarvitaan reaktio-olosuhteiden optimoimiseksi. Molemmat karakterisoidut proteiinit kuitenkin osoittivat EXLX-proteiineille tyypillistä kykyä aiheuttaa muutoksia puumassan mikrorakenteeseen, mikä on tässä työssä havainnollistettu pyyhkäisyelektronimikroskoopilla.

Description

Supervisor

Master, Emma

Thesis advisor

Haddad Momeni, Majid

Keywords

microbial expansin-like proteins, gene expression, protein purification, enzyme synergy, Pichia pastoris, lignocellulose degradation

Other note

Citation