Engineering of N-glycosylation in Saccharomyces cerevisiae
Loading...
URL
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
School of Chemical Engineering |
Doctoral thesis (article-based)
| Defence date: 2022-03-04
Unless otherwise stated, all rights belong to the author. You may download, display and print this publication for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Authors
Date
Major/Subject
Mcode
Degree programme
Language
en
Pages
108 + app. 48
Series
Aalto University publication series DOCTORAL THESES, 24/2022
Abstract
N-glycosylation is a post-translational modification with a significant impact on the properties of therapeutic proteins. Most therapeutic proteins are currently produced using mammalian cells due to the requirement of correct post-translational modifications, especially N-glycosylation. Yeast Saccharomyces cerevisiae is a commonly utilized organism with many advantages over mammalian cells. However, the N-glycan structures generated in yeasts are not suitable for therapeutic use, preventing the utilization of yeast for the production of therapeutic glycoproteins. Engineering of the N-glycosylation pathway in yeast could overcome this challenge. Although different yeast glycoengineering approaches have been developed, efficient human-compatible glycosylation has not yet been obtained in S. cerevisiae, and in-depth knowledge is lacking on the consequences of glycoengineering on the quality and quantity of the produced protein. This work aims to further develop a glycoengineering approach based on ALG3 and ALG11 deletions in S. cerevisiae and to gain better understanding of the connection between glycoengineering and intracellular protein quality control. First, the interfering mannosylation taking place in the glycoengineered Δalg3 Δalg11 S. cerevisiae strain could be partially eliminated by the deletion of MNN1 gene. In addition, optimization of the expression constructs of human GnTI and GnTII, coexpression of a UDP-GlcNAc transporter and supplementation of glucosamine into the growth medium improved the efficiency of complex-type glycan formation. The introduction of galactose residues to hybrid-like and complex-type glycans via the expression of a human GalTI fused to a galactose epimerase domain from Schizosaccharomyces pombe was additionally demonstrated. Second, the impact of glycoengineering on intracellular protein quality control was studied from the perspective of recombinant protein production. The glycoengineered Δalg3 Δalg11 strain generates a Man3GlcNAc2 glycan intermediate that lacks the glycan structures normally serving as recognition signals for the endoplasmic reticulum protein quality control system. The impact of glycoengineering on the endoplasmic reticulum-associated protein degradation (ERAD) pathway was investigated by monitoring the impact of ALG3, ALG11 and ERAD gene deletions on intracellular processing of an IgG model protein. In Δalg3 Δalg11 strain, intracellular IgG was targeted for ERAD independently of Yos9p and Htm1p. Upon expression of ALG3, ERAD targeting was dependent on Yos9p but Htm1p was not required. Our findings suggest that ERAD targeting of a protein can occur via other mechanisms than the established Htm1p and Yos9p-dependent route when the N-glycan biosynthesis pathway is altered. Although several challenges remain to be tackled, glycoengineered S. cerevisiae has potential to become an alternative production platform for therapeutic proteins and enable production of glycoproteins with human-compatible N-glycosylation pattern.N-glykosylaatio on translaation jälkeinen muokkaus, jolla on merkittävä vaikutus terapeuttisten proteiinien ominaisuuksiin. Monet terapeuttiset proteiinit sisältävät N-glykaaneja, ja useimmat niistä tuotetaan käyttäen nisäkässoluviljelmiä. Saccharomyces cerevisiae -hiiva on tuotanto-organismi, jolla on monia etuja nisäkässoluihin verrattuna. Hiivan tuottamat N-glykaanirakenteet eroavat kuitenkin ihmissolujen tuottamista glykaaneista, minkä takia hiivaa ei voida käyttää terapeuttisten glykoproteiinien tuottamiseen. Tämä voitaisiin kuitenkin mahdollistaa muokkaamalla hiivan N-glykosylaatioreittiä geeniteknisesti. Vaikka hiivojen N-glykosylaation muokkaamiseen on kehitetty erilaisia lähestymistapoja, S. cerevisiae -hiivassa terapeuttiseen käyttöön soveltuvaa N-glykosylaatiota ei ole vielä saavutettu. Lisäksi tieto glykosylaation muokkauksen vaikutuksista hiivassa tuotetun proteiinin laatuun ja määrään on puutteellista. Tässä työssä pyritään kehittämään ALG3- ja ALG11-geenien poistoihin perustuvaa glykosylaation-muokkausmenetelmää S. cerevisiae -hiivassa ja ymmärtämään paremmin glykosylaation muokkauksen ja solunsisäisen proteiinin laadunvalvonnan yhteyttä. Glykosylaatioltaan muokatussa Δalg3 Δalg11 S. cerevisiae -kannassa esiintyvän häiritsevän mannosylaation määrää saatiin vähennettyä MNN1-geenin poistolla. Lisäksi ihmisen GnTI- ja GnTII -geenien ilmentämisen optimointi, UDP-GlcNAc-transportterin ilmentäminen ja glukosamiinin lisääminen kasvualustaan paransivat kompleksityyppisten glykaanien muodostumisen tehokkuutta. Myös galaktosyloituja hybridi- ja kompleksityyppisiä glykaaneja onnistuttiin muodostamaan ilmentämällä ihmisen GalTI-entsyymistä ja Schizosaccharomyces pombe -hiivan galaktoosiepimeraasista koostuvaa fuusioproteiinia. Väitöskirjassa tutkittiin myös glykosylaation muokkauksen vaikutusta solunsisäiseen proteiinin laadunvalvontaan. Δalg3 Δalg11 -hiivakannan muodostamasta Man3GlcNAc2-glykaanista puuttuvat solulimakalvoston proteiinien laadunvalvontajärjestelmässä tunnistussignaaleina toimivat rakenteet. Tämän vaikutusta solulimakalvoston proteiinien hajoamisreitin (ERAD) toimintaan tutkittiin seuraamalla hiivassa tuotetun IgG-proteiinin solunsisäistä käsittelyä ERAD-reittiin liittyvien geenien sekä ALG3- ja ALG11-geenien deleetioiden kanssa. Δalg3 Δalg11 -kannassa osa solunsisäisistä IgG-molekyyleistä ohjautui ERAD-hajoamiseen Yos9p- ja Htm1p-proteiineista riippumatta. ERAD-hajoamiseen ohjautumista havaittiin myös ALG3-geenin läsnä ollessa, jolloin Yos9p osallistui ERAD-ohjautumiseen Htm1p-proteiinista riippumatta. Näiden tulosten perusteella N-glykaanien biosynteesireittiä muokattaessa proteiinin ERAD-hajoaminen voi tapahtua myös muuten kuin tunnetulla Htm1p- ja Yos9p-riippuvaisella mekanismilla. Vaikka useita haasteita on vielä ratkaisematta, S. cerevisiae -hiivasta on mahdollista kehittää glykosylaation muokkauksen avulla tuotto-organismi, jota voitaisiin käyttää nisäkässoluviljelmien sijasta N-glykosyloitujen terapeuttisten proteiinien tuotantoon.Description
Supervising professor
Frey, Alexander, Prof., Aalto University, Department of Bioproducts and Biosystems, FinlandKeywords
Other note
Parts
-
[Publication 1]: Piirainen M, Boer H, de Ruijter J and Frey A. 2016. A dual approach for improving homogeneity of a human-type N-glycan structure in Saccharomycescerevisiae. Glycoconjugate Journal 33(2), 189-199.
Full text in Acris/Aaltodoc: http://urn.fi/URN:NBN:fi:aalto-201701191191DOI: 10.1007/s10719-016-9656-4 View at publisher
-
[Publication 2]: Piirainen M, Salminen, H and Frey A. 2022. Production of galactosylated complex-type N-glycans in glycoengineered Saccharomyces cerevisiae. Applied Microbiology and Biotechnology 106(1), 301-315.
Full text in Acris/Aaltodoc: http://urn.fi/URN:NBN:fi:aalto-202201101059DOI: 10.1007/s00253-021-11727-8 View at publisher
-
[Publication 3]: Piirainen M and Frey A. 2020. Investigating the role of ERAD on antibody processing in glycoengineered Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Research 20(1) foa002.
Full text in Acris/Aaltodoc: http://urn.fi/URN:NBN:fi:aalto-202002122112DOI: 10.1093/femsyr/foaa002 View at publisher